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目的：
1.明确Spartin在糖尿病心脏微血管内皮细胞中的表达变化并探索Spartin在糖尿病心脏微血管内皮损伤中的作用。
2.验证氧化应激反应是否介导了Spartin的内皮细胞效应。
3.探究白脂素(Asprosin, Asp)能否在糖尿病中通过Spartin途径发挥心脏微血管内皮保护作用。
方法：
1.将C57BL/6J健康雄性野生型(Wild Type, WT)小鼠和痉挛性截瘫-20(Spastic Paraplegia-20, SPG20)敲除小鼠分为WT组(20只)、SPG20-/-组(20只)。同时给予两组小鼠高热量的饲料喂养3w后，行腹腔注射链脲佐菌素(50 mg/kg/d)连续5d，再用高热量的饲料进行饲养，直到小鼠2型糖尿病造模成功。再将2型糖尿病的WT小鼠和SPG20-/-小鼠分为Vehicle组、Asp组和Asp+SPG20-/-组。Vehicle组是将已经造模成功的2型糖尿病WT小鼠在腹腔内注射与Asp等量的生理盐水。Asp组是在2型糖尿病WT小鼠的基础上每天进行腹腔注射1μg/g的Asp1次，持续2w。Asp+SPG20-/-组是在2型糖尿病的SPG20-/-小鼠基础上每天进行腹腔注射1μg/g的Asp1次，持续2w。(1)利用小动物超声检测小鼠心脏舒张功能；(2)利用透射电镜检测心脏微血管内皮的完整性。
2.将小鼠心脏微血管内皮细胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells, CMECs)分为正常组(Normal Glucose, NG)和高糖组(High Glucose, HG)。NG组培养基中葡萄糖的浓度为5.5mmol/l，HG组培养基中葡萄糖的浓度为30mmol/l。在高糖的条件下将CMECs分为Vehicle组和siRNA-Spartin组。Vehicle组仅用转染试剂处理，siRNA-Spartin组细胞给予转染试剂+siRNA(50 nmol/ Spartin siRNA)处理。此外，在下调Spartin的条件下将小鼠CMECs分为siRNA-Spartin组和siRNA-Spartin+N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine, NAC)组。siRNA-Spartin组通过siRNA下调Spartin，siRNA-Spartin+NAC在通过siRNA下调Spartin的条件下再使用NAC清除活性氧簇(Reacive Oxygen Species, ROS)。最后，在高糖的条件下将小鼠CMECs分为Vehicle组、Asp组和Asp+siRNA-Spartin组。Vehicle组仅用溶剂处理，Asp组通过30nmol/l的Asp干预，Asp+siRNA-Spartin组在siRNA下调Spartin的条件下再使用30nmol/l的Asp干预。(1)通过qRT-PCR和Westernblot分别检测Spartin的基因和蛋白表达水平；(2)通过流式细胞学技术检测小鼠CMECs凋亡水平的变化；(3)通过一氧化氮(Nitric Oxide, NO)荧光探针和ELISA试剂盒检测存活小鼠CMECs中NO的含量；(4)通过透射电镜观察CMECs中线粒体结构相应的变化；(5)通过超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium, DHE)及ROS的ELISA试剂盒检测小鼠CMCEs内ROS的生成。
结果：
1.本实验在小鼠CMECs上成功地检测到了Spartin的表达，通过qRT-PCR和Westernblot检测发现，与NG组相比，HG组小鼠CMECsSpartin的基因和蛋白水平均明显降低。
2.在体实验中，本实验引入SPG20-/-小鼠以构建2型糖尿病模型。造模完成后发现，与WT组相比，SPG20-/-组糖尿病小鼠心脏超声E/A比值明显降低、心脏微血管内皮的完整性显著下降。在体外实验中，通过siRNA下调Spartin的表达后用高糖干预，结果发现，与Vehicle组相比，siRNA-Spartin组小鼠CMECs凋亡水平显著增加，NO生成明显减少。
3.同时，在体外实验中，与Vehicle组相比，siRNA-Spartin组高糖条件下小鼠CMECs的线粒体结构的完整性显著破坏，ROS的生成显著增加。
4.在体外实验中，本实验通过NAC清除细胞内ROS的含量。结果发现，与siRNA-Spartin组相比，siRNA-Spartin+NAC组高糖条件下小鼠CMECs线粒体的结构破坏被部分逆转了，ROS的含量明显降低。
5.在体外实验中，通过Asp对高糖条件下的细胞进行干预。结果发现，与Vehicle组相比，Asp组小鼠CMECsSpartin的基因和蛋白水平显著增加。同时，Asp组小鼠CMECs凋亡水平明显减低，NO生成显著增加。但siRNA下调Spartin表达部分逆转了以上作用。同时，在线粒体水平，与Vehicle组相比，Asp组线粒体的结构破坏明显减轻，ROS生成显著减少，但是siRNA下调Spartin表达部分逆转了以上作用。在体内实验中，通过Asp对2型糖尿病的WT和SPG20-/-的小鼠进行干预。结果发现，与WT组相比，Asp组心脏超声E/A比值和心脏微血管的完整性明显增加，但敲除SPG20部分逆转了此作用。
结论：
Asp可通过Spartin信号途径抑制高糖诱导的小鼠CMECs内的氧化应激过度的反应，从而减轻糖尿病心脏微血管损伤。
1.明确Spartin在糖尿病心脏微血管内皮细胞中的表达变化并探索Spartin在糖尿病心脏微血管内皮损伤中的作用。
2.验证氧化应激反应是否介导了Spartin的内皮细胞效应。
3.探究白脂素(Asprosin, Asp)能否在糖尿病中通过Spartin途径发挥心脏微血管内皮保护作用。
方法：
1.将C57BL/6J健康雄性野生型(Wild Type, WT)小鼠和痉挛性截瘫-20(Spastic Paraplegia-20, SPG20)敲除小鼠分为WT组(20只)、SPG20-/-组(20只)。同时给予两组小鼠高热量的饲料喂养3w后，行腹腔注射链脲佐菌素(50 mg/kg/d)连续5d，再用高热量的饲料进行饲养，直到小鼠2型糖尿病造模成功。再将2型糖尿病的WT小鼠和SPG20-/-小鼠分为Vehicle组、Asp组和Asp+SPG20-/-组。Vehicle组是将已经造模成功的2型糖尿病WT小鼠在腹腔内注射与Asp等量的生理盐水。Asp组是在2型糖尿病WT小鼠的基础上每天进行腹腔注射1μg/g的Asp1次，持续2w。Asp+SPG20-/-组是在2型糖尿病的SPG20-/-小鼠基础上每天进行腹腔注射1μg/g的Asp1次，持续2w。(1)利用小动物超声检测小鼠心脏舒张功能；(2)利用透射电镜检测心脏微血管内皮的完整性。
2.将小鼠心脏微血管内皮细胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells, CMECs)分为正常组(Normal Glucose, NG)和高糖组(High Glucose, HG)。NG组培养基中葡萄糖的浓度为5.5mmol/l，HG组培养基中葡萄糖的浓度为30mmol/l。在高糖的条件下将CMECs分为Vehicle组和siRNA-Spartin组。Vehicle组仅用转染试剂处理，siRNA-Spartin组细胞给予转染试剂+siRNA(50 nmol/ Spartin siRNA)处理。此外，在下调Spartin的条件下将小鼠CMECs分为siRNA-Spartin组和siRNA-Spartin+N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine, NAC)组。siRNA-Spartin组通过siRNA下调Spartin，siRNA-Spartin+NAC在通过siRNA下调Spartin的条件下再使用NAC清除活性氧簇(Reacive Oxygen Species, ROS)。最后，在高糖的条件下将小鼠CMECs分为Vehicle组、Asp组和Asp+siRNA-Spartin组。Vehicle组仅用溶剂处理，Asp组通过30nmol/l的Asp干预，Asp+siRNA-Spartin组在siRNA下调Spartin的条件下再使用30nmol/l的Asp干预。(1)通过qRT-PCR和Westernblot分别检测Spartin的基因和蛋白表达水平；(2)通过流式细胞学技术检测小鼠CMECs凋亡水平的变化；(3)通过一氧化氮(Nitric Oxide, NO)荧光探针和ELISA试剂盒检测存活小鼠CMECs中NO的含量；(4)通过透射电镜观察CMECs中线粒体结构相应的变化；(5)通过超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium, DHE)及ROS的ELISA试剂盒检测小鼠CMCEs内ROS的生成。
结果：
1.本实验在小鼠CMECs上成功地检测到了Spartin的表达，通过qRT-PCR和Westernblot检测发现，与NG组相比，HG组小鼠CMECsSpartin的基因和蛋白水平均明显降低。
2.在体实验中，本实验引入SPG20-/-小鼠以构建2型糖尿病模型。造模完成后发现，与WT组相比，SPG20-/-组糖尿病小鼠心脏超声E/A比值明显降低、心脏微血管内皮的完整性显著下降。在体外实验中，通过siRNA下调Spartin的表达后用高糖干预，结果发现，与Vehicle组相比，siRNA-Spartin组小鼠CMECs凋亡水平显著增加，NO生成明显减少。
3.同时，在体外实验中，与Vehicle组相比，siRNA-Spartin组高糖条件下小鼠CMECs的线粒体结构的完整性显著破坏，ROS的生成显著增加。
4.在体外实验中，本实验通过NAC清除细胞内ROS的含量。结果发现，与siRNA-Spartin组相比，siRNA-Spartin+NAC组高糖条件下小鼠CMECs线粒体的结构破坏被部分逆转了，ROS的含量明显降低。
5.在体外实验中，通过Asp对高糖条件下的细胞进行干预。结果发现，与Vehicle组相比，Asp组小鼠CMECsSpartin的基因和蛋白水平显著增加。同时，Asp组小鼠CMECs凋亡水平明显减低，NO生成显著增加。但siRNA下调Spartin表达部分逆转了以上作用。同时，在线粒体水平，与Vehicle组相比，Asp组线粒体的结构破坏明显减轻，ROS生成显著减少，但是siRNA下调Spartin表达部分逆转了以上作用。在体内实验中，通过Asp对2型糖尿病的WT和SPG20-/-的小鼠进行干预。结果发现，与WT组相比，Asp组心脏超声E/A比值和心脏微血管的完整性明显增加，但敲除SPG20部分逆转了此作用。
结论：
Asp可通过Spartin信号途径抑制高糖诱导的小鼠CMECs内的氧化应激过度的反应，从而减轻糖尿病心脏微血管损伤。