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线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）所引起的氧化应激是心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤重要的病理生理过程。应激活化蛋白激酶JNK在多种细胞应激包括I/R刺激引起的损伤中起重要作用。新近研究表明，胞浆中JNK可结合到线粒体外膜Sab蛋白上，导致线粒体内Src失活，进而抑制电子传递链，使线粒体ROS生成增加，引起肝脏损伤。我们前期研究结果表明，心肌来源的 H9c2细胞及心脏微血管内皮细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）时，可引起胞浆中ROS生成及p-JNK表达增加。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F2）是我们课题组自主研发的一种新型化合物，在大鼠整体的I/R模型以及心肌细胞离体H/R模型中均有保护心肌作用，其作用机制包括降低胞浆中ROS水平，抑制JNK活化，改善细胞氧化应激等。 目的： 借助于H9c2细胞H/R模型，探讨线粒体中是否存在JNK/Sab/Src/ROS信号通路引起线粒体氧化应激，进而引起 H/R损伤。在此基础上，研究 H/R时 F2是否通过线粒体JNK/Sab/Src/ROS信号通路减轻线粒体氧化应激损伤进而保护心肌细胞。 方法： ⑴H9c2细胞H/R模型的建立：利用低氧/厌氧工作站，结合不同缺氧条件，在不同的H/R时程下，探讨建立 H/R模型的最佳方法：MTT法检测细胞生存率，流式细胞术检测ROS水平，荧光显微镜观察细胞形态变化，Western Blot方法检测总磷酸化JNK（p-JNK）、总JNK表达。⑵将培养的 H9c2细胞随机分为以下几组：对照（control）组、H/R+JNK抑制剂（H/R+SP600125）组、H/R+转染阴性对照（negative control, NC）siRNA（H/R+NC siRNA）组、H/R+Sab siRNA组、control+Src抑制剂（control+PP2）组、H/R+F2组、H/R+F2+JNK激动剂（H/R+ F2+Aniso）组。control组细胞于实验前换用新鲜培养基持续培养细胞3 h；H/R组加入缺氧液，置于低氧/厌氧工作站（1％O2、5%CO2、94%N2，37℃）中，2 h后换用完全培养基于常规条件下培养细胞1 h；H/R+ SP600125组于缺氧前预先孵育SP600125（20μM）45 min；H/R+NC siRNA组、H/R+Sab siRNA组于缺氧前细胞分别转染NC或Sab siRNA序列6 h，换用含10%FBS Opti-MEM培养基持续培养至48 h；control+PP2组于常氧条件下孵育PP2（10μM）12 h；H/R+F2组于缺氧前预先孵育F2（10μM）30 min，并于缺氧阶段继续给予F22 h；H/R+F2+Aniso组于缺氧前孵育F2（10μM）30 min，缺氧阶段给予F2和Aniso（20ng/mL）2h。⑶Western Blot方法检测线粒体内p-JNK、Sab、Src蛋白表达，激光共聚焦显微镜或流式细胞术检测线粒体内ROS水平：分别借助JNK抑制剂、Sab siRNA、Src抑制剂明确H9c2细胞H/R时线粒体内是否存在JNK/Sab/Src/ROS信号通路及F2于其中的作用。⑷免疫荧光技术检测H/R时，p-JNK和Sab的蛋白表达和空间定位，探讨两蛋白间是否存在相互作用。⑸羟胺法、流式细胞术、荧光显微镜分别检测线粒体MnSOD活力、NAO荧光水平及线粒体膜电位变化，探讨H9c2细胞H/R时JNK/Sab/Src/ROS信号通路对线粒体氧化应激损伤的影响及F2于其中的作用。 结果： ①与对照组比较，缺氧时以完全培养基和无糖培养基处理的H9c2细胞H/R后，细胞内 ROS含量和细胞存活率随缺氧时间延长无明显改变，且倒置显微镜下未观察到明显的形态变化。缺氧时以酸性缺氧液处理的H9c2细胞，随H/R时程的延长，细胞内ROS含量不断增加，细胞存活率逐渐降低，细胞逐渐皱缩成圆形，胞浆中p-JNK表达明显上升，在H:6 h/R:1 h后，p-JNK表达降低，但与其它模型组相比，差异无统计学意义。②H9c2细胞H/R时，p-JNK转位于线粒体，并与Sab蛋白结合，Src脱磷酸化，线粒体内ROS生成增加，MnSOD活性、线粒体膜电位及NAO水平降低。③JNK抑制剂SP600125可抑制H/R时p-JNK的线粒体转位、Src脱磷酸化、线粒体ROS生成及MnSOD活性降低，升高NAO水平及线粒体膜电位，但对Sab蛋白水平无影响。H/R前给予Sab siRNA可下调p-JNK的线粒体转位，抑制Src脱磷酸化，降低线粒体ROS水平，升高MnSOD活性、NAO水平及线粒体膜电位。Src抑制剂PP2增加线粒体内ROS生成，降低MnSOD活性、NAO水平及线粒体膜电位。④F2可抑制H/R所致线粒体p-JNK和p-Src蛋白异常表达，抑制p-JNK和Sab于线粒体上的表达共定位，抑制线粒体内 ROS的生成，并降低线粒体氧化应激损伤包括升高MnSOD活性、NAO水平及线粒体膜电位。 结论： ⑴H/R可导致H9c2细胞线粒体内JNK/Sab/Src/ROS信号通路激活，引起线粒体氧化应激损伤。⑵F2可抑制H/R所致的JNK/Sab/Src/ROS信号通路激活，由此拮抗心肌H/R诱导的线粒体氧化应激损伤，这是其保护I/R心肌的重要机制之一。