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抗坏血酸(L-ascorbic acid, AsA)又名维生素C,是维持人类正常生长发育所必需的化合物,但人类自身不能合成AsA,因而不得不从能合成AsA的动植物中获取,富含AsA的蔬菜和水果是人类摄取AsA的主要来源。刺梨(Rosa roxburghii Tratt)是蔷薇科蔷薇亚科蔷薇属植物,是一种原产于我国西南的新兴果树,刺梨果实含有多种对人类有益的化学物质,尤其是富含AsA,鲜果AsA含量达到2200mg/100gFW,因而备受关注,成为新兴的“Vc之王”。然而,对于刺梨果实积累如此高含量的AsA的分子机制尚不清楚。本文以三个基因型的刺梨为实验材料,从形态、细胞、生理、生化、分子等层面系统地研究了刺梨果实发育过程中,与果实AsA积累有关的AsA的合成、氧化分解、还原再生、运输和调控的变化和差异,并对可能导致刺梨积累高含量AsA的关键基因进行了验证,获得如下主要结果：1.刺梨果实发育过程中三个基因型的刺梨果实AsA含量变化趋势基本相同,只是最终AsA含量有一定的差异,其中MpFl达到1542mg/100gFW。刺梨果实在花后40天内几乎没有明显AsA积累,99%的AsA是在之后的发育过程中快速积累的,其中花后65天至80天是积累速率最高的时期,15天积累的AsA接近总含量的一半。而叶片AsA的含量在果实发育过程中始终没有明显变化,平均含量只有成熟果实的1/100到1/30。2.刺梨果实发育过程中果实AsA的细胞学分布变化反映了AsA含量的变化。细胞内,AsA主要分布在细胞质中,而在液泡中分布极少；细胞间,AsA主要分布在果实的肉质中果皮内,尤其在靠近输导组织的细胞中分布较多,而在外果皮分布极少。在果实发育初期,含量极少,分布也不明显,而在果实发育后期,含量急剧上升,分布区域化也很明显。3.刺梨果实发育过程中AsA合成和分解相关代谢物的含量变化也一定程度上支持了AsA含量的变化模式。L-半乳糖途径合成AsA的前体或中间产物的含量的变化与AsA的积累速率的变化趋势较一致,而AsA的各种分解产物的含量在整个果实发育过程中一直处于较低水平；另外主要有机酸的含量的变化,与AsA的含量变化趋势相似性很高。4.克隆了参与刺梨AsA合成代谢的全部重要基因共14个,分析了三个基因型材料中这些基因在果实发育过程中表达变化,其中循环途径的脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因的表达变化与AsA的积累变化相似性最高。在所有合成路径中,L-半乳糖途径的GDP甘露糖表异构酶(GME)基因的表达变化最能反映AsA积累速率的变化；另外,D-半乳糖醛酸途径的关键基因半乳糖醛酸还原酶(GalUR)基因在果实发育中期有显著高表达,而肌醇途径基因在果实发育中后期基本不表达。5.分析了果实发育过程中部分参与AsA合成代谢的酶活性在刺梨的变化,其中合成途径的酶活性没有显著变化,而DHAR酶活性的变化与AsA含量的变化保持了较高同步性。还测定了果实发育过程中AsA和脱氢抗坏血酸(DHA)含量的变化,发现AsA氧化还原状态的变化与DHAR的基因表达和酶活性的变化表现出很高一致性。6.分析了刺梨不同组织器官AsA和DHA的含量在果实发育过程中的变化,除了果实外,其他组织器官的DHA含量均显著高于AsA含量,且DHA含量在果实成熟时从小叶、萼片、叶柄到果肉、种子、枝条依次降低。DHA的细胞学定位显示DHA主要分布在光合组织和输导组织中,且与果实中AsA的分布有紧密的联系。7.克隆了刺梨DHAR和GME的全长cDNA,命名为RrDHAR和RrGME,比对和聚类分析表明它们都是作用于细胞质的基因。还克隆了普通草莓(Fragaria x ananassa)的DHAR全长cDNA,与RrDHAR的同源性高达93%,两者推导的蛋白在个别氨基酸位点有差异。此外还克隆了刺梨的AO和APX的全长cDNA,分析显示AO作用于质外体,而APX作用于细胞质。8.构建了RrDHAR和RrGME的超量表达载体并稳定转化了拟南芥,超量表达RrGME将拟南芥叶片的T-AsA含量提高了80%,将AsA提高了7.2倍,将AsA氧化还原水平的提高3.3倍；而超量表达RrDHAR将T-AsA含量提高了40%,将AsA提高了9.7倍,且将AsA氧化还原水平的提升是超量表达RrGME的两倍。检测转基因株系的荚果也得到了与叶片相近的结果。9.克隆了RrDHAR和RrGME的基因全长和部分启动子序列,启动子分析发现它们的启动子除了都包含了基本的启动子元件外,还都含有大量的光调控相关的顺式元件,且明显多于野草莓(Fragaria vesca)中同源基因的启动子。综上所述,刺梨果实的AsA主要在中果皮的细胞质中积累,在果实发育过程中,果实高含量AsA的积累是合成途径与循环途径共同作用的结果。L-半乳糖途径是刺梨AsA合成的主要途径,其中RrGME可能是控制半乳糖AsA合成的关键基因,而D-半乳糖醛酸途径在果实发育中期对AsA合成有一定的贡献。最为重要的是,循环途径的RrDHAR在果实发育后期对DHA的还原作用是果实积累和维持高含量AsA的关键。此外,DHA的长距离运输也可能参与到果实积累AsA的过程中,但同样必须依赖RrDHAR的还原作用。RrDHAR不仅表现出了极强的AsA还原再生的能力,在调控刺梨果实发育过程中AsA含量方面也起到了非常关键的作用。