呼吸道病毒是在世界范围内引起呼吸道疾病的常见原因之一。可引起的疾病包括从普通的上呼吸道感染到严重的系统性疾病直至死亡。经调查显示：流感病毒甲、乙型(influenza virus A，IFA：influenza virus B，IFB)，副流感病毒1、3型(parainfluenza virus 1，PIV1；parainfluenza virus 3，PIV3)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、人类鼻病毒(human rhinovirus，hRV)和人类柯萨奇病毒(human coxsackievirus，hCV)可导致绝大多数的病毒性呼吸道感染。婴幼儿、老年人以及患有严重心肺疾病和免疫缺陷的病人感染这些病毒之后极易引发各种并发症如哮喘，支气管和肺炎。甲型流感病毒可被进一步细分为16个血凝素(hemagglutinin，HA)亚型和9个神经氨酸苷酶(neuraminidase，NA)亚型，其中只有H1亚型、H2亚型、H3亚型建立了稳定的人类谱系。禽流感病毒是甲型流感病毒中感染禽类的多种甲型流感病毒亚型的总称，近年来禽流感中的H5N1，H7N7，H7N3和H9N2屡次发生感染人的事件，已经引起了公共卫生当局和科学界的广泛关注。目前认为抗病毒治疗是控制呼吸道病毒流行的手段之一，而早期诊断对开展有效特异性病原治疗有重要意义。 近年来，基于核酸基础上的分子诊断在临床上已占有了重要的地位。本次研究在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的基础上，建立了多重实时荧光定量PCR的方法和多重逆转录聚合酶链式反应结合流过式反向斑点杂交的方法(multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction combined with Flow-Through Reverse Dot Blotting，mRT-PCR-FT-RDB)用于禽流感病毒和常见呼吸道RNA病毒的快速检测。通过优化方法，提高了检测的灵敏度和特异性，并初步应用于临床资料分析和诊断。目的：建立一种多重实时荧光定量PCR检测禽流感病毒的方法，达到敏感且特异地同时检测禽流感病毒H5亚型和H9亚型的目的。 方法：使用甲型流感病毒株和禽流感病毒株的RNA建立多重实时荧光定量PCR的检测方法。针对甲型流感病毒共有的Matrix基因和亚型特异性基因H5基因和H9基因设计引物和Taqman探针，并将其应用于一次多重实时荧光定量PCR反应中，以达到同时检测三种荧光信号的目的。使用标准病毒株和阳性质粒DNA来测定该方法的特异性和灵敏度。用广州来源的47例咽拭子标本来评价和验证所建立方法在临床应用中的灵敏度和特异性。 结果：该方法可以同时检测甲型流感病毒包括H5，H9亚型，且灵敏度达到每反应10拷贝。 结论：多重实时荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异性地检测到包括禽流感病毒亚型H5和H9在内的甲型流感病毒。该法操作简便，报告周期短，适用于大规模的筛查，尤其能在可能发生的大爆发中发挥作用。 背景：由呼吸道病毒引起的临床症状不具有特异性。病毒分离培养和免疫荧光检测等传统检测手法敏感度低且费时。 目的：反向斑点杂交技术整合最新的流过式杂交原理，为了达到可以同时检测多种常见呼吸道RNA病毒的目的。 方法：使用标准病毒株建立多重逆转录PCR结合流过式反向斑点杂交的检测方法。通过分析Genebank上的序列来设计引物探针。使用标准病毒株的半数组织培养感染量(50％tissue culture infective dose，TCID50)来测定该方法的灵敏度，并使用其他病毒株来测定该法的特异性。通过与金标准比较，用广州来源的200例标本来评价该方法检测临床标本的灵敏度和特异性。 结果：该检测方法的灵敏度为0.01-0.1TCI0D50／ml，并具有很高的特异性。标本检测表明，该方法与作为金标准的病毒分离培养法和免疫荧光法相比较，灵敏度达到100％，特异性达到98％。 结论：建立的多重逆转录PCR结合流过式反向斑点杂交检测呼吸道RNA病毒的方法快速、可靠并且廉价。相对于传统方法来说，它更适用于临床应用。 背景：建立的多重逆转录PCR结合流过式反向斑点杂交技术检测呼吸道RNA病毒的方法具有快速、简便、准确的特点。由于病毒分离培养法的局限性，呼吸道RNA病毒在发热病人中的流行病学特征以及其可能对临床表现存在的影响却鲜见报道。 目的：研究呼吸道RNA病毒在广州地区发热病人中的发病情况及伴随的相关临床症状以期寻找在发展中国家中与呼吸道病毒相关的流行病学特点。望能对发热病人的诊断和治疗提供一些线索。 方法：用第二章建立的多重逆转录PCR结合流过式反向斑点杂交方法检测了600例来自发热门诊中疑似有呼吸道感染的病人的咽拭子标本，同时记录标本资料和临床资料。对呼吸道RNA病毒的发生率和呼吸道RNA病毒相关的临床症状进行分析。 结果：呼吸道RNA病毒在334例病人中被检出。通过分析证实呼吸道RNA病毒在不同年龄和不同性别中的分布无统计学差异，而在不同季节中的分布有统计学差异。同时，呼吸道RNA病毒与患者的发热程度和临床症状也有统计学关系。结论：呼吸道RNA病毒在发热病人中的分布与其他呼吸道病毒感染的人群相比较为一致，但同时也有独有的特征。