地黄和白术病毒病病原检测及病毒全基因组序列测定与分析

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地黄(Rehmannia glutinosa)为玄参科药用草本植物,是著名的四大怀药之一。白术(Atractylodes macrocephala Koidz)为菊科苍术属多年生草本植物,与人参齐名,是我国出口创汇的十大拳头中药品种之一。近几年,随着人工栽培面积的增大,地黄、白术遭受病毒侵染和衰退的现象日趋严重,给相关产业造成了巨大的经济损失。本文对山西绛县表现花叶、皱缩和矮化等症状的地黄、白术病样进行了分子检测与鉴定,接着又对地黄、白术病毒分离物进行了全基因组序列克隆与分析。(1)通过生物学接种指示植物,初步证明山西绛县自然感病的地黄、白术病害很可能是由病毒引起的;(2)通过提取病毒双链RNA (dsRNA),并以其为模板进行非序列依赖性PCR扩增(SIA),发现山西绛县地黄受油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus, YoMV)和地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus, ReMV)复合侵染;白术受蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2, BBWV2)侵染,将三种分离物分别命名为YoMV-SX. ReMV-SX和BBWV2-Am.(3)为进一步明确YoMV-SX, ReMV-SX和BBWV2-Am的分类地位,对YoMV-SX、 ReMV-SX和BBWV2-Am的全基因组序列进行分段克隆、序列测定和分析。结果表明YoMV-SX基因组全长6304nt,具有烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的典型特征,含有4个开放阅读框(open reading frame, ORF)。全序列核苷酸同源性分析显示YoMV-SX与Tobamovirus亚组Ⅰ、Ⅱ中的分离物同源性为50.2%-63.3%,与亚组Ⅲ中的油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus, YoMV)同源性为90.7%-96.0%。全序列系统进化分析显示,YoMV-SX与YoMV-Wh形成一个独立分支,亲缘关系最近。YoMV-SX所编码的4种蛋白中,外壳蛋白(CP)最保守,而移动蛋白(MP)变异最大。ReMV-SX基因组全长6395nt,也属于Tobamovirus,含有4个ORF.全序列核苷酸同源性分析显示ReMV-SX与Tobamovirus亚组Ⅱ、Ⅲ分离物同源性为49.8%-58.9%,与亚组Ⅰ中的ReMV同源性93.8%-97.0%。全序列系统进化分析显示,ReMV-SX与ReMV-Henan形成一个独立分支,亲缘关系最近。ReMV-SX所编码的4种蛋白中,MP变异最大,而复制酶相关蛋白最保守。BBWV2-Am具有蚕豆病毒属(Fabavirus)的典型特征,为二分体病毒,其中RNA1全长5949nt,含有1个ORF。全序列核苷酸同源性分析显示BBWV2-Am RNA1与BBWV2其他分离物核苷酸同源性在78.6%-93.3%之间。全序列系统进化分析显示,BBWV2-Am RNA1与BBWV2-MB7株系以及同属的PatMMV-Philippines株系聚为一簇,亲缘关系最近,而与同属的BBWV1-Ben株系亲缘关系最远。BBWV2-Am RNA2全长3548nt,含有1个ORF。全序列核苷酸同源性分析显示BBWV2-Am RNA2与BBWV2其他分离物核苷酸同源性在79.3%-88.5%之间,全序列系统进化分析显示,BBWV2-Am RNA2与BBWV2-Rehmannia glutinosa L株系形成一个独立分支,亲缘关系最近,与BBWV1-Ben株系亲缘关系最远。BBWV2-Am RNA2所编码的运动蛋白(VP53/VP37)、LCP和SCP氨基酸变异情况各不相同,其中VP53/VP37变异最大,LCP最保守。
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