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背景尽管针对呼吸心跳骤停和心肺脑复苏进行了数十年的实验室和临床研究,但目前其生存率依然较低。在发达国家,40%~50%经抢救存活的病人因为暂时性全脑缺血将产生长期严重的神经功能障碍,这其中68%的病人最终由于中枢神经系统损伤死亡,这一比例在发展中国家往往更高。除了日常生活中心血管意外事件、意外伤害外,手术中大量失血和各种原因引起的心脏停跳也是引起全脑缺血从而产生神经功能障碍的重要原因。因此如何减轻由于脑缺血引起的神经损伤在今后很长一段时间内都将是一个倍受关注的研究课题。我们前期的研究证实非缺血预处理方式中异氟醚预处理可以明显减轻局灶型脑缺血再灌注引起的神经损伤、改善神经功能,并且吸入性麻醉药物在临床实际使用过程中安全方便,因此具有广泛推广应用的临床前景。近年研究发现,生物体内普遍存在且高度保守的Notch信号通路在细胞分化和个体生长发育以及一系列生理、病理过程中都扮演的非常重要的角色;在神经系统中与神经元分化、成熟、再生以及功能形成以及神经系统退行性病变存在着密切的关系,然而Notch信号通路是否参与非缺血预处理的诱导的神经保护作用机制尚未明确。本研究旨在探讨异氟醚预处理在全脑缺血中的神经保护作用,从而进一步揭示Notch信号通路与神经保护之间存在的关系,阐明机制、寻找关键“靶点”,为非缺血预处理的临床运用提供科学依据。实验一异氟醚预处理在全脑缺血中的神经保护作用研究目的探讨异氟醚预处理在全脑缺血中的神经保护作用,为其机制研究奠定基础。方法采用双侧颈总动脉阻闭的方法,制作小鼠全脑缺血模型。雄性C57BL/6小鼠24只,(18~22g, 12周龄)随机分为3组,(n=8):预处理缺血组,小鼠接受1.2%异氟醚与98%氧气混合吸入预处理1小时/天,连续5天,末次预处理24小时后行双侧颈总动脉阻闭全脑缺血20分钟;单纯缺血对照组,小鼠接受98%氧气吸入1小时/天,连续5天,末次吸氧24小时后行双侧颈总动脉阻闭全脑缺血20分钟;假手术组,小鼠接受1.2%异氟醚与98%氧气混合吸入预处理1小时/天,连续5天,但不行全脑缺血手术操作。分别在再灌注24、48、72小时由不了解实验分组人员进行运动功能评分,末次评分后取脑行HE及TUNEL染色并在高倍镜下进行海马CA1区神经元计数。结果1.血气分析:结果显示动物接受预处理前10分钟,预处理进行30分钟,预处理结束后10分钟三个时间点血气改变无明显差异,排除低氧血症影响。2.运动功能评分(TMS):假手术组动物无运动神经功能改变。预处理缺血组动物评分均高于同一时间点单纯缺血对照组评分(P<0.05),提示运动功能优于单纯缺血对照组。3.正常神经元计数:假手术组HE染色海马CA1区未见神经元损伤,再灌注72小时后该区域正常神经元计数预处理缺血组数量明显多于单纯缺血对照组(P<0.05)。4. TUNEL阳性神经元计数:再灌注72小时后海马CA1区TUNEL阳性神经元计数预处理缺血组数量明显少于单纯缺血对照组(P<0.05)。结论异氟醚预处理可以诱导脑缺血耐受并对全脑缺血产生神经保护作用。实验二Notch信号通路参与异氟醚预处理诱导神经保护作用的研究目的观察Notch信号在异氟醚预处理诱导神经保护中的表达情况,建立预处理与Notch信号变化之间的关系。方法雄性C57BL/6小鼠96只,(18~22g, 12周龄)随机分为4组:①预处理缺血组(n=36),小鼠接受1.2%异氟醚与98%氧气混合吸入预处理1小时/天,连续5天,末次预处理24小时后行双侧颈总动脉阻闭全脑缺血20分钟;②单纯缺血对照组(n=36),小鼠接受98%氧气吸入1小时/天,连续5天,末次吸氧24小时后行双侧颈总动脉阻闭全脑缺血20分钟;③假手术组(n=12),小鼠不接受预处理或吸氧,也不行全脑缺血手术操作;④单纯预处理组(n=12),小鼠接受1.2%异氟醚与98%氧气混合吸入预处理1小时/天,连续5天。其中预处理缺血组、单纯缺血对照组于再灌注2、24、72小时、假手术组于末次预处理后24小时、单纯预处理组于末次预处理后2、24小时分别进行免疫荧光染色以及Western blot、Real-Time PCR。结果1.免疫荧光:结果显示假手术组Notch胞内活性片段NICD表达微弱,单纯缺血对照组NICD表达2、24小时逐渐增高但荧光强度弱于同时间点的预处理缺血组,但单纯缺血对照组72小时NICD表达强度强于同时间点的预处理缺血组。2. Western blot:单纯缺血对照组NICD表达量在再灌注2、24、72小时逐步增高,均强于假手术组(P<0.05);预处理缺血组NICD表达量在再灌注2、24小时强于同时间点单纯缺血对照组(P<0.05)但在再灌注72小时弱于同时间点的单纯缺血对照组(P<0.05),单纯预处理组2小时NICD表达量强于假手术组(P<0.05),但在24小时两者没有差异;3. Real-Time PCR:受体Notch-1 mRNA表达在单纯缺血对照组再灌注2、72小时增高,且高于假手术组(P<0.05),预处理缺血组Notch-1表达量在再灌注2、24小时强于同时间点单纯缺血对照组(P<0.05)但在再灌注72小时弱于同时间点的单纯缺血对照组(P<0.05);靶基因HES-1 mRNA表达单纯缺血对照组在再灌注2、24小时逐步增高,均高于假手术组(P<0.05);预处理缺血组表达量在再灌注2、24小时强于同时间点单纯缺血对照组(P<0.05)但在再灌注72小时两组表达量较假手术组相比没有统计学差异,单纯预处理组2小时Notch-1、HES-1表达均高于假手术组(P<0.05)。结论异氟醚预处理可以使Notch信号通路相关分子Notch-1、NICD、HES-1表达高峰较单纯缺血时程前移,提示Notch信号通路参与了异氟醚预处理诱导的神经保护作用。实验三阻断Notch信号通路对异氟醚预处理诱导神经保护作用的影响研究目的探讨使用Notch信号通路抑制剂后异氟醚预处理诱导的神经保护作用变化情况。方法雄性C57BL/6小鼠58只,(18~22g, 12周龄)随机分为6组:①DAPT+预处理缺血组(n=8),小鼠接受1.2%异氟醚与98%氧气混合吸入预处理1小时/天,连续5天,并在每次预处理前3小时注射DAPT(100mg/kg),末次预处理24小时后行双侧颈总动脉阻闭全脑缺血20分钟;②溶剂+预处理缺血组(n=8),小鼠接受1.2%异氟醚与98%氧气混合吸入预处理1小时/天,连续5天,并在每次预处理前3小时注射等体积抑制剂溶剂,末次预处理24小时后行双侧颈总动脉阻闭全脑缺血20分钟;③D APT+单纯缺血对照组(n=8),小鼠接受98%氧气吸入1小时/天,连续5天,并在每次吸氧前3小时注射DAPT(100mg/kg),末次吸氧24小时后行双侧颈总动脉阻闭全脑缺血20分钟;④溶剂+单纯缺血对照组(n=8),小鼠接受98%氧气吸入1小时/天,连续5天,并在每次吸氧前3小时注射等体积抑制剂溶剂,末次吸氧24小时后行双侧颈总动脉阻闭全脑缺血20分钟;⑤假手术组(n=8),小鼠接受1.2%异氟醚与98%氧气混合吸入预处理1小时/天,连续5天,但不行全脑缺血手术操作;⑥抑制剂验证组(n=18);其中①~⑤组动物分别在再灌注24、48、72小时由不了解实验分组人员进行运动功能评分,末次评分后取脑行HE及TUNEL染色并在高倍镜下进行海马CA1区神经元计数。⑥组动物在腹腔单次注射抑制剂DAPT (100mg/kg)后1、2、3、6、12、24小时取脑行Western blot观察NICD表达变化情况。结果1.运动功能评分(TMS):DAPT+预处理缺血组运动功能评分再灌注24、48、72小时均低于同时间点溶剂+预处理缺血组(P<0.05),但仍然高与同时间点DAPT+单纯缺血对照组和溶剂+单纯缺血对照组评分并有统计学差异(P<0.05),DAPT+单纯缺血对照组运动功能评分再灌注48、72小时高于溶剂+单纯缺血对照组(P<0.05)。2.正常神经元计数:DAPT+预处理缺血组再灌注72小时海马CA1区正常神经元计数低于同时间点溶剂+预处理缺血组(P<0.05),但仍然多于同时间点DAPT+单纯缺血对照组和溶剂+单纯缺血对照组(P<0.05),DAPT+单纯缺血对照组再灌注72小时正常神经元计数多于溶剂+单纯缺血对照组(P<0.05)。3. TUNEL阳性神经元计数:DAPT+预处理缺血组再灌注72小时海马CA1区TUNEL阳性神经元计数高于同时间点溶剂+预处理缺血组(P<0.05),但仍然少于同时间点DAPT+单纯缺血对照组和溶剂+单纯缺血对照组(P<0.05)。DAPT+单纯缺血对照组再灌注72小时TUNEL阳性神经元计数少于溶剂+单纯缺血对照组(P<0.05)。4.抑制剂效果验证:DAPT(100mg/kg)腹腔注射后3小时达到抑制高峰,并维持抑制效果24小时以上。结论DAPT部分逆转了异氟醚预处理诱导的全脑缺血神经保护作用,表明Notch信号通路的激活是异氟醚预处理诱导脑缺血耐受的重要机制。小结1.异氟醚预处理可以诱导中枢神经系统缺血耐受并对全脑缺血再灌注产生神经保护作用。2.异氟醚预处理可以使Notch信号通路相关分子Notch-1、NICD、HES-1表达高峰较单纯缺血时程前移,提示Notch信号通路参与了异氟醚预处理诱导的神经保护作用。3. Notch信号通路阻断剂DAPT部分逆转了异氟醚预处理诱导的全脑缺血神经保护作用,表明Notch信号通路的激活是异氟醚预处理诱导脑缺血耐受的重要机制。