研究背景在脓毒血症中,由入侵病原体引起的免疫反应,由于无法恢复内环境稳定,从而使病理综合症达到顶峰,其特征是持续的过度炎症和免疫抑制,在临床上可导致全身多脏器的功能紊乱和衰竭。现已知炎症介质有补体成分、花生四烯酸代谢产物、肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素、血小板活化因子、巨噬细胞前炎症细胞因子、蛋白酶、凝血恶烷和氧自由基等。激活的巨噬细胞正是这些炎症因子的主要来源之一。严重的细菌感染后巨噬细胞通过TLR/NF-κB途径被激活,随后产生了促炎性细胞因子(例如IL-1β、TNF-α)和趋化因子的分泌,进一步趋化更多的免疫细胞到感染部位,并释放大量的细胞因子,这导致“细胞因子风暴”产生,最终导致致命性脓毒血症性休克综合征以及多器官功能衰竭。因此,抑制巨噬细胞的炎性状态,逐渐恢复稳态,这对脓毒血症的恢复显得非常重要。大黄素是一种羟基蒽醌类物质,具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗真菌、抗原虫作用,已有报道大黄素能够在脓毒血症中发挥抗炎作用,但是否与巨噬细胞直接相关还不清楚,是否能够调节巨噬细胞炎性因子的分泌还需要进一步证实。研究目的探讨大黄素是否能够抑制LPS诱导小鼠脓毒血症的发展,并进一步探讨这种作用是否通过调控巨噬细胞分泌细胞因子实现的。研究方法(一)通过体内实验探讨大黄素的抗炎作用是否与巨噬细胞有关。用腹腔注射LPS构建小鼠脓毒血症模型,2h后,腹腔注射大黄素。24后,取外周血分离血清,用于细胞因子检测。取肝、肺组织,用于病理检测,观察损伤程度和炎症浸润情况。(二)通过体外实验分析大黄素发挥抗炎作用的机制。首先,培养小鼠的骨髓来源的巨噬细胞(BMDM),加入不同浓度的大黄素,探讨在正常情况下是否对巨噬细胞发挥调控作用。其次,培养小鼠的BMDM,用LPS刺激2h后,再加入不同浓度的大黄素,作用24h后,取细胞培养上清,用ELISA的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β的释放进行检测;取细胞的mRNA,用QPCR的方法对细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β的表达进行检测。研究结果1.大黄素能够抑制LPS诱导的小鼠炎症LPS处理组的小鼠表现出急性肺泡损伤和炎症的特征,例如充血、中性粒细胞积聚和肺泡壁明显增厚。LPS+大黄素组显示脓毒血症引起的损害减少,肺部和肝部炎症减少,甚至还可见到正常组织学特征。此外,大黄素能够降低小鼠血清中炎症因子TNF-α的含量、促进了IL-10的分泌。2.大黄素能够降低LPS诱发小鼠BMDM表达炎症性细胞因子在基因水平上,大黄素对TNF-α的表达没有明显的影响,但是却降低了IL-1β的表达,对于抗炎因子IL-10和TGF-β来说,均表现升高的状态。而在蛋白水平,大黄素明显降低了TNF-α和IL-1β的释放,对IL-10和TGF-β却没有明显的影响。3.大黄素可影响BALB/C小鼠BMDM的TNF-α,IL-1β和TGF-β的基因表达不同浓度(10uM、20uM、40uM)大黄素均可以降低小鼠BMDM的TNF-α、IL-1β和TGF-β的基因表达,对IL-10的基因表达无影响。在蛋白水平只对TNF-α的分泌起到抑制作用。结论大黄素能够抑制LPS诱导的小鼠炎症,而这个作用是通过直接降低小鼠巨噬细胞的炎症因子TNF-α、IL-1β实现的,并在基因水平调控了IL-10和TGF-β的表达。