替加环素（Tigecycline,TGC）是临床上治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线之一,而tet（X）变体可以介导高水平TGC耐药性,因此tet（X）变体的出现与传播严重威胁着临床用药的选择性和公共卫生健康。我国多个省份发现了tet（X）变体,它的快速传播不仅与质粒载体有关,还与插入序列共同区域2（Insertion Sequence Common Region 2,ISCR2）有关。ISCR2由一个转座酶基因和两端的保守序列组成,转座酶属于HUH内切酶家族（H表示组氨酸、U表示大的疏水性氨基酸,HUH表示氨基酸基序）,具有滚环复制的特点。ISCR2没有末端反向重复序列,也不产生靶位点正向重复,它的转座机制不同于典型的插入序列,有待进一步探究。尽管tet（X）变体的宿主菌种属和质粒载体类型具有多样性,tet（X）变体的基因环境却高度保守,ISCR2是位于保守基因环境末端的元件,也是最邻近tet（X）变体的可移动元件,因此ISCR2可能与tet（X）变体的传播有关。在有些tet（X）变体宿主菌中,能检测到保守基因环境形成的环状dsDNA,这种环状结构目前被认为是ISCR2介导tet（X）变体转座过程中形成的中间体,但缺乏相关证据,中间体的形成机制也尚不明晰。本研究主要通过全基因组测序、生物信息学分析、IPCR（Inverse PCR）和质粒构建等方法发现ISCR2通过同源重组产生环状dsDNA中间体。通过IPCR、转化试验、转座试验、接合转移试验、质粒消除和稳定性试验等方法对ISCR2产生的中间体的表型、移动性和稳定性进行进一步探究,发现中间体不能独立介导耐药,但能插入到质粒或染色体上从而使宿主耐药,并具有较高的稳定性,且TGC可刺激中间体的形成。论文具体内容如下:1.tet（X）变体基因环境比较分析本研究从不同省份的猪场中分离出5株对TGC高耐药的野生Escherichia Coli（E.coli）,它们均携带tet（X4）,测序结果显示tet（X4）均位于质粒上,包括3个Inc X1质粒,1个Inc Q1质粒和1个Inc FIA（HI1）/Inc HI1A/Inc HI1B（R27）杂合质粒。tet（X4）的基因环境高度保守,且它的上下游至少有一个完整的ISCR2元件。在ISCR2-hp-abh-tet（X4）-ISCR2和△ISCR2-hp-abh-tet（X4）-ISCR2基因环境下检测到环状dsDNA中间体ISCR2-hp-abh-tet（X4）,但在ISCR2-hp-abh-tet（X4）-△ISCR2和hpabh-tet（X4）-ISCR2环境下没有检测到中间体。2.环状dsDNA中间体的产生机制探究通过质粒构建发现ISCR2的转座酶能催化下游或上游同源臂同源重组形成环状dsDNA中间体。转座酶不仅能催化ISCR2两端的保守序列同源重组,也能催化与ISCR2无关的非保守序列同源重组,表现出催化序列非特异性。3.环状dsDNA中间体的表型探究通过转化试验探究中间体的表型。环状dsDNA中间体aad A-Paad A-ISCR2（aad A介导大观霉素抗性,Paad A是aad A的启动子）导入DH5α后不能筛选出耐大观霉素的转化子,但带有复制子ori的环状结构ori-aad A-Paad A-ISCR2导入DH5α后可以筛选出耐大观霉素的转化子;表明ISCR2产生的环状dsDNA中间体不同于质粒结构,不能独立介导耐药。4.环状dsDNA中间体的可移动性探究通过转座试验探究环状dsDNA中间体的可移动性。环状dsDNA中间体aad APaad A-ISCR2导入携带ISCR2质粒的宿主后,能够筛选出耐大观霉素的转化子;消除该质粒则不能筛选出耐大观霉素的转化子,表明环状dsDNA中间体能插入到DNA大分子中,ISCR2可通过产生环状dsDNA中间体在分子间传播耐药基因。5.环状dsDNA中间体的稳定性探究通过无抗传代试验探究中间体的稳定性。将携带环状dsDNA中间体的野生E.coli连续无抗传代至160代,依旧有＞80%的子代菌株携带中间体,不能检测到中间体的子代菌在TGC的刺激下可再次检测到中间体,表明环状中间体具有较高的稳定性,且TGC可促进中间体的形成,禁用TGC可在一定水平抑制tet（X）变体的传播。ISCR2通过同源重组形成环状中间体,而环状中间体可以在DNA分子水平传播tet（X）变体,从而传播TGC耐药性。ISCR2形成的环状中间体具有较高的稳定性和移动性,可能在TGC耐药性的传播中具有重要作用和意义。