β-（2,6）果聚糖（Levan）和菊糖是自然界中天然存在的两种β-果聚糖。Levan被报道具有改善肠道微环境、降低脂肪吸收、调节血糖水平等生理功能,并被逐渐开发利用成乳化剂、稳定剂和表面活性剂。相比于菊糖,直接从植物提取得到的Levan含量较少,且聚合度较低。利用微生物发酵和生物酶法转化可以制备高分子量的Levan;其中,微生物来源的β-（2,6）果聚糖蔗糖酶（Levansucrase,LSase,EC 2.4.1.10）可以利用蔗糖为底物,经一步酶反应得到Levan,具有广阔的应用前景。尽管LSaes能够催化蔗糖合成Levan,但不同微生物来源的LSaes在合成Levan时具有显著的产物链长分布特异性,对应的Levan分子量也从10³到10⁸ Da不等。研究表明,不同分子量Levan的理化性质和实际用途存在一定的差异。如低分子量的Levan被报道具有一定的益生功能;而高分子量的Levan则更多地被应用在水溶胶等领域。本论文基于基因文库共享信息与序列对比,选择来自微生物Brenneria sp.Eni D312的LSase作为研究对象,构建了重组质粒,并在大肠杆菌Escherichia coli中成功实现了重组酶的可溶性高效表达。同时,针对酶催化性质和产物性质分别进行了测定;针对酶的热稳定性进行了两种方式的功能强化;针对酶的晶体结构进行了探究,并结合点突变实现了Levan链长分布的改变,具体研究内容和结论如下:（1）Brenneria sp.Eni D312中编码LSase的基因片段在NCBI中的编号为Br E312＿3941,蛋白登录号为EHD23269.1。同时,核苷酸序列分析显示这段基因包含了一个长度为1314 bp的开放阅读框,能够翻译出一个含438个氨基酸的蛋白质,理论亚基分子量为48,530 Da。构建重组质粒p ET-22b-Brsp-LSase,并将其转化至感受态细胞E.coli BL21（DE3）。经1 m M IPTG诱导目的蛋白表达,并通过镍亲和层析和凝胶排阻色谱纯化目的蛋白。SDS-PAGE电泳验证在49 k Da处出现目标蛋白条带,符合理论分子量。重组LSase的水解最适温度是50°C,最适p H是7.5;但转果糖苷反应的最适温度是45°C,最适p H出现在6.5。重组酶具有较弱的热稳定性,35、45和55°C的半衰期分别为4.6 h,2.1 h和42 min。二价金属离子Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺等对酶的催化活力影响不大,表明Brsp-LSase并非严格金属离子激活型或金属离子依赖性。以200 g/L蔗糖为底物,Brsp-LSase的转果糖苷活力和水解活力分别为414 U/mg和153 U/mg,表明Brsp-LSase催化蔗糖的过程中,转果糖苷反应占主导。同时,米氏常数K_m为367 mmol/L,V_max为20.12 mmol/min,催化效率k_cat/K_m为290.17/min。对制备的产物进行结构鉴定,证实产物是为以β-（2,6）相连的Levan;对Brsp-LSase制备Levan的加酶量和底物浓度等条件进行优化。结果表明,当加酶量和底物浓度分别为2.5 U/m L和250 g/L时,经6 h后反应能够达到平衡;达到平衡时的Levan产量为85 g/L,平衡转化率为34%。（2）测定制备得到的Levan分子量为1.41×10⁸ g/mol,同时它的PD值为1.28,表明其分子量分布较为集中。从扫描电镜和原子力显微镜的结果分析,Levan能够在水溶液中形成均一分散的颗粒。同时,热力学性质测定显示Levan的分解温度、熔化温度（T_m）和熔化焓（ΔH_m）分别为216.67°C、147.41°C和76.9 J/g。流变性质测定显示,3%的Levan水溶液表现为典型的“牛顿型流体”,即它拥有相对恒定的表观粘度值;而6%、9%和12%的Levan溶液的粘度随着剪切速率的增大而减小,出现剪切变稀现象。同时,当Levan在水溶液中的浓度从8%增加到10%时,它的凝胶强度会明显增大;此外,10%浓度下Levan所测得的凝胶强度值和1%的黄原胶以及0.5%的卡拉胶较为接近。（3）结合序列比对与蛋白结构B-factor分析提出Brsp-LSase中第404位氨基酸残基对其热稳定性的重要影响,并在404位设计引入了19个突变体。经过比较,19个突变体中,E404F,E404I,E404W,E404V和E404L这五个突变体的K_m与原始酶相当,表明突变体没有对改变酶对底物蔗糖的结合能力,但它们的热稳定性均要比原始酶有不同程度的提高。其中,E404L突变体的T_m值比原始酶高出了2.8°C,同时35和45°C下的半衰期也比原始酶分别提高了12.5和1.3倍。从宏观和微观层面分别探究了在404位引入疏水氨基酸后突变体酶热稳定性提高的原因,主要包括第十四与第十五对β发夹结构的增强、活性口袋附近疏水环境的改善以及蛋白结构中N端和C端共同形成的“夹具”效应。（4）首次研究了不同分子量的PEG对Brsp-LSase酶活力的影响,当酶液中添加10%的PEG 4000时,所测得的酶活力是原始酶的1.24倍。同时发现PEG 4000对Brsp-LSase的热稳定性具有一定的促进作用。当Brsp-LSase与5%PEG 4000在35和45°C分别保温6 h后,残余活力分别提高了1.2倍和3.3倍。但10%的PEG 4000对Brsp-LSase的热稳定性促进作用与5%的PEG 4000的作用较为接近。原子力显微镜观察到当Brsp-LSase与PEG 4000共同保温后,PEG 4000能够在Brsp-LSase酶分子外围形成一圈“保护膜”。同时,PEG 4000不仅能够降低热处理后的Brsp-LSase蛋白分子表面疏水指数,还提高了Brsp-LSase二级结构中α-螺旋和β-折叠的含量;内源荧光测定结果显示PEG 4000能够提高热处理后Brsp-LSase在340 nm下的荧光强度。（5）解析得到了高分辨率的Brsp-LSase原始酶、突变体D68N与底物蔗糖的复合物结构,以及突变体酶A154S和H327A的晶体结构。和原始酶相比,突变体A154S的总活力几乎保持一致,但转糖苷/水解反应的比例从原先的2.7变成了1.4;而突变体H327A不再具有合成高分子量β-（2,6）果聚糖的能力,只能形成聚合度DP≤6的寡糖。H327A突变体酶形成的寡糖主要是6-kestose和部分1-kesotse,其中6-kestose的产量为18.4 g/L,转化率为9.2%（底物:200 g/L蔗糖）。对H327A突变体分析,发现第327位的组氨酸空间上与第374位的酪氨酸具有堆积作用;同时与葡糖基的2-OH之间具有氢键相互作用。当其突变成丙氨酸之后,失去了堆积效应,从而减弱了与蔗糖之间的相互作用。同时,该组氨酸正处于Brsp-LSase上的loop7位置,而loop7上的残基被推测具有寡糖的结合能力。当其突变成丙氨酸时,对其他寡糖结合位点有所减弱,进而导致它仅仅能合成DP≤6的寡糖分子。当第154位的残基由丙氨酸突变成丝氨酸后,丝氨酸会与亲核攻击蔗糖的第68位天冬氨酸形成一定的氢键作用。由于D68自身是需要去进攻蔗糖分子的,因此第154位的丝氨酸所形成的相互作用会迫使D68亲核攻击的效率有所降低,从而导致其转糖苷/水解反应的比例有所降低。