吸烟是全球最受关注的一个公众卫生问题,被认为是动脉粥样硬化和高血压等心血管疾病的主要诱发因素之一。尼古丁作为香烟烟雾的主要组成成分及成瘾剂,对心血管系统的损伤同样引人注目。已有的研究表明,尼古丁可以诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的迁移与增殖。然而,该病理过程的分子机制尚未完全阐明。本实验室前期研究表明,尼古丁会影响血管平滑肌细胞中4种细胞骨架蛋白（包括β-肌动蛋白、γ-肌动蛋白、原肌球蛋白4和F-肌动蛋白）以及RhoGDIA（鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂,Rho GTPase通路的负调节因子）的表达。因此,在本研究中,我们主要针对Rho GTPase通路观察了RhoGDIA在尼古丁诱导的血管平滑肌细胞异常行为学中的作用。我们利用组织贴壁法从小鼠胸主动脉中进行原代血管平滑肌细胞的体外培养,并采用了10μM的尼古丁处理浓度（体外）,该浓度与吸烟者血浆中测定的尼古丁浓度一致(10^–5到10^–8 M)。同时,6周龄的C57BL/6J小鼠以每日0.2毫克/100克（白天分4次间隔注射）的剂量进行尼古丁腹腔注射,建立小鼠尼古丁暴露模型。尼古丁的体内注射含量根据世界卫生组织―重度吸烟的定义‖（≥20支香烟/天）确定。由于衰老小鼠体内血管的病变机制非常复杂,因此我们对性成熟的小鼠进行尼古丁处理20 W,旨在模仿整个中青年时期尼古丁暴露的条件。我们首先用免疫荧光染色与Western Blotting的方法测定了8种细胞骨架相关蛋白——α-肌动蛋白、β-肌动蛋白、F-肌动蛋白、肌球蛋白轻链（MLC）,磷酸化的肌球蛋白轻链（p-MLC）、肌间线蛋白（desmin）、钙调节蛋白（calponin）和钙调素结合蛋白（caldesmon）的表达。同时,为了确定Rho GTPase途径与尼古丁诱导的细胞骨架蛋白的表达改变有关,在培养基中先加入α-BtX（α7-乙酰胆碱受体特异性拮抗剂）和Y27632（Rho激酶抑制剂）进行预处理。结果表明,尼古丁处理显著增加了VSMCs中细胞骨架相关蛋白的表达,而α-BtX及Y27632的加入则极大地抑制了相关蛋白的表达上调。为了深入了解尼古丁对Rho GTPase信号通路的影响,我们随后检测了Rho GTPase通路中3个主要蛋白的活性（即RhoA-GTP、RAC1-GTP和CDC42-GTP）及通路下游主要的效应信号分子的表达情况（如肌球蛋白磷酸酶目标蛋白亚基-1（MYPT-1）、P21活化激酶（PAK-1）和PI3K/AKT）。结果表明,尼古丁可以通过激活Rho GTPase通路、活化其下游信号分子、最终诱导VSMCs中细胞骨架蛋白的合成,促进VSMCs的迁移与增殖。其次,为了进一步研究其中的作用机制,我们对Rho GTPase通路的相关基因进行了检测。利用半定量PCR和免疫印迹分析,发现尼古丁处理后,RhoGDIA的转录水平上调、蛋白水平下调,提示了VSMCs中存在RhoGDIA的转录后调控机制。随后,通过生物信息学、双荧光素酶报告基因检测及免疫印迹验证,我们发现microRNA-200b（miR-200b）在尼古丁处理后的VSMCs中表达上调,其可以通过直接作用于RhoGDIA mRNA的3′-UTR区,抑制其蛋白的翻译表达。同时,miR-200b mimics对VSMCs的转染可明显促进血管平滑肌细胞的迁移与增殖,而转染miR-200b mimics后活化状态的RhoA、RAC1和CDC42的比例明显下降则表明,miR-200b主要是通过抑制RhoGDIA表达、提高Rho GTPase的活化比例来发挥其作用的。最后,我们还对尼古丁处理后VSMCs中miR-200b的表达上调进行了机制研究。通过对miR-200b基因启动子区进行了分析,发现了其启动子区存在较多的CpG位点。BSP测序结果表明,尼古丁处理后miR-200b启动子区的DNA甲基化率（甲基化的CpG位点个数/CpG位点总数）明显下调（对照组为88%,尼古丁处理组为56.7%）。而甲基化的下调更多发生在检测位点1、3、5、6和9处。运用5-杂氮-2′-脱氧胞苷进行的MSP实验也表明,随着启动子区DNA甲基化率的下降,miR-200b的表达逐渐升高。上述研究结果表明,尼古丁可以通过降低miR-200b基因启动子区的DNA甲基化率、上调miRNA-200b的表达,抑制RhoGDIA的翻译,最终导致Rho GTPase通路活性升高、促进血管平滑肌细胞的迁移与增殖。这一新发现为理解血管平滑肌细胞的迁移与增殖提供了新视角,为吸烟（或尼古丁）诱导动脉粥样硬化等心血管疾病的研究提供了新方向。