急T-淋巴细胞白血病是一种以骨髓和外周血中未成熟T细胞积聚为特征的血液恶性肿瘤。即使接受了高剂量的多药化疗或造血干细胞移植等积极的治疗方案，付出巨大的急性和长期副作用的代价，仍有约15%的儿童患者和40%的成人患者因为获得治疗耐药性而复发；生存前景黯淡。因此探究T-ALL的分子发病机制，寻找可应用于T-ALL治疗的细胞表面蛋白对患者的个性化治疗、降低化疗毒性、提高患者的生存时间具有重要意义。　　CD59分子是一种参与T淋巴细胞活化和信号转导的GPI锚定蛋白。CD59可以阻止C9结合C5b678复合物，影响膜攻击复合物的形成，以帮助肿瘤细胞逃避免疫监控。在大部分实体瘤中CD59的表达水平都明显高于相邻的正常组织，相比较其他的膜补体调节蛋白它更直接或间接的参与了癌变和肿瘤进展，发挥了并有可能是多种肿瘤治疗的有效靶点。但是在急性淋巴细胞白血病中，CD59与白血病细胞增殖与凋亡之间的具体关系和作用机制却需要进一步探讨。另有研究表明在T-ALL发生和进展过程中，涉及多种突变或过度激活的信号通路如ERK、AKT、STAT3、Notch1等，信号途径特异性抑制剂，也成为设计肿瘤治疗药物的一条思路。因此本课题通过体内和体外实验，分析了CD59在急性T淋巴白血病进展中的作用，初步探讨了急性T淋巴白血病中调控细胞增殖、分化和凋亡的几条关键信号途径与CD59表达的相关性。试图通过寻找与CD59作用相关的上下游的关键蛋白，研究CD59及其分子机制，为疾病的治疗寻求新的靶点。　　CD59的核磁共振三维结构分析发现， Phe23、Cys39、Trp40、Leu53残基形成一活性区域。这些残基位于疏水沟内，其中Trp40位于疏水沟的底面。集中于Trp40的保守疏水沟是CD59补体活性位点，是CD59分子发挥补体抑制功能的重要功能残基。本课题通过比较分析了W40位点敲除后CD59功能的变化，进一步研究此位点在CD59中的关键作用，为基因靶向敲除在肿瘤治疗的应用提供基础的资料。　　另课题组前期研究发现，在动脉粥样硬化等疾病中，与CD59分子有协同作用的载脂蛋白E(apolipoproteinE，ApoE)在多种肿瘤中也过表达，但其在淋巴细胞白血病中的作用尚未报道。因此本课题组浅显分析了ApoE在淋巴细胞白血病中的基急T-淋巴细胞白血病是一种以骨髓和外周血中未成熟T细胞积聚为特征的血液恶性肿瘤。即使接受了高剂量的多药化疗或造血干细胞移植等积极的治疗方案，付出巨大的急性和长期副作用的代价，仍有约15%的儿童患者和40%的成人患者因为获得治疗耐药性而复发；生存前景黯淡。因此探究T-ALL的分子发病机制，寻找可应用于T-ALL治疗的细胞表面蛋白对患者的个性化治疗、降低化疗毒性、提高患者的生存时间具有重要意义。　　综上所述，本课题组从以下几个方面进行了深入研究。首先临床样本中发现，在急性T淋巴细胞白血病患者骨髓T淋巴细胞表面存在CD59的高表达。随后，本课题组选用急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat细胞进行体外实验。发现Jurkat细胞中CD59不仅具有补体调节功能，还参与细胞增殖和凋亡。通过构建的急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型也验证，CD59过表达促进了T淋巴白血病细胞的增殖；而CD59分子Trp40位点的突变降低了CD59分子抑制凋亡的功能。并且本课题组初步探究了CD59调控细胞凋亡相关的信号通路和可能的分子机制。　　目的：　　1、研究收集到的临床急T-淋巴细胞白血病患者骨髓T-淋巴细胞表面CD59的表达；利用收集到的临床淋巴瘤样本研究CD59、Bcl-2、Bax与淋巴瘤恶性转化的相关性。　　2、通过构建并研究CD59稳定高表达，CD59稳定高表达但W40位点突变，CD59稳定高表达但K41位点突变的Jurkat细胞株，探究CD59过表达，及W40、K41位点突变对Jurkat细胞增殖、抗补体、凋亡等生物学功能的影响。　　3、构建急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型，为研究人类淋巴细胞白血病发生和发展规律提供便利。并利用构建的急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型，研究淋巴细胞中CD59过表达和W40位点突变对白血病进展的影响。　　4、探究CD59调控Jurkat细胞凋亡过程中涉及的信号途径。　　5、分析正常人群与急性T淋巴细胞白血病人中ApoE基因型的多态性分布。　　方法：　　1、收集32例急性T淋巴细胞白血病患者和32例健康者的骨髓样本，利用流式细胞仪进行了CD59阳性分析。收集40例T-淋巴瘤样本和40例B-淋巴瘤样本，利用免疫组织化学检测样本中CD59、Bcl-2、Bax的表达情况。　　2、利用基因工程技术构建CD59、CD59 W40突变、CD59 K41突变表达慢病毒，并通过慢病毒感染，建立了CD59稳定高表达、CD59稳定高表达但W40位点突变、CD59稳定高表达但K41位点突变的Jurkat细胞株。通过荧光显微镜观察绿色荧光，流式细胞仪检测增强绿色荧光蛋白的表达，实时定量PCR检测各组细胞CD59的mRNA水平，检测是否已成功构建细胞株。利用CCK8实验检测各组细胞增殖情况。通过染料释放实验检测各组细胞对补体介导的细胞溶解作用的敏感性。通过台盼蓝染色检测各组细胞死亡比例。利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，并进行实时定量PCR和western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。使用ELISA检测各组细胞培养液中IL-2的浓度。　　3、分别尾静脉注射正常Jurkat细胞、CD59稳定高表达Jurkat细胞株、CD59稳定高表达但W40位点突变的Jurkat细胞株到裸鼠体内，构建急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型。观察记录裸鼠食欲，体重等一般情况。检测外周血白细胞数量，并通过HE染色分析各脏器白细胞浸润情况。利用流式细胞仪检测外周血、骨髓的细胞凋亡情况。通过免疫组织化学检测脾脏中Bcl-2和Bax的表达情况。　　4、Western blot检测正常Jurkat细胞、CD59敲低Jurkat细胞、CD59过表达细胞和W40位点突变的Jurkat细胞中ERK、AKT、STAT3、Notch1信号途径关键蛋白的表达。添加AKT特异性抑制剂BEZ235，研究AKT信号途径阻断对细胞凋亡的影响。　　5、收集正常人群与急性T淋巴细胞白血病人外周血进行基因芯片分析。　　结果：　　1、急性T淋巴细胞白血病患者骨髓T淋巴细胞中CD59的阳性表达率明显高于正常组。CD59在T-淋巴瘤和B-淋巴瘤中都呈强阳性表达。但统计学分析表明，CD59的过表达与淋巴瘤的恶性转化无关。Bcl-2在20例低度恶性T-淋巴瘤中皆为阴性表达，在中高度恶性T-淋巴瘤中阳性率为55%，差异具有统计学意义；Bcl-2在低度恶性B-淋巴瘤的阳性率为61.9%，在高度恶性B-淋巴瘤的阳性率为100%，统计数据分析P<0.05。Bax在低度恶性的T-淋巴瘤的阳性率为65%，在中高度恶性的T淋巴瘤中的阳性率为20%，差异有统计学意义；Bax在低度恶性B-淋巴瘤的阳性率为85.71%，高度恶性B-淋巴瘤的阳性率为31.58%，统计分析具有显著性差异。　　2、各组细胞均有均匀的绿色荧光，绿色荧光蛋白的表达均在85%以上。各组Jurkat细胞中CD59 mRNA水平上调。CD59过表达显著促进了细胞增殖，抑制了细胞凋亡；K41位点突变对该作用无影响，但W40位点突变降低了CD59对细胞凋亡的抑制作用。CD59过表达促进了IL-2的分泌。W40位点突变的Jurkat细胞IL-2的分泌减少。CD59过表达促进了抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白表达，抑制了促凋亡蛋白Bax的mRNA和蛋白表达。W40突变的细胞株其CD59促进Bcl-2表达和抑制Bax表达的作用明显降低。　　3、构建的急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型在四周后出现白血病症状，包括食欲下降、皮肤褶皱、弓背、体质量下降，外周血中白细胞数目明显增多。CD59过表达的裸鼠模型（WT组）中，体质量下降最严重，外周血中白细胞数目最多，脾脏中淋巴细胞的比例也最大。而CD59虽然过表达，但W40功能位点突变的裸鼠模型（M1组）与Jurkat组无显著性差异。在成功构建的急性T淋巴细胞裸鼠模型中发现，Jurkat细胞中CD59分子的过表达显著的抑制了外周血细胞、骨髓细胞和脾脏淋巴细胞的凋亡，并促进了IL-2的分泌。对脾脏组织切片免疫组化结果表明， Jurkat细胞中CD59分子的过表达促进了Bcl-2的表达，抑制了Bax的表达。而在此过程中， W40位点属于关键性功能位点。若W40位点突变后， CD59抑制凋亡、促进IL-2分泌、调节Bcl-2和Bax表达的功能减弱。　　4、与CON组细胞相比，CD59低表达细胞组，促凋亡蛋白caspase3、Bax、Bim的表达量上调，抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量下调，且变化有显著性差异（P<0.05）。CD59高表达细胞组，促凋亡蛋白caspase3、Bax、Bim的表达量下调，抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量上调且变化有显著性差异（P<0.05）。与CD59过表达组相比，W40组细胞的caspase3、Bax、Bim的表达量上调，抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量下调，与CON组细胞相比，且变化有显著性差异（P<0.05）。各组细胞中p-ERK、ERK、AKT的表达量均无显著性差异。与CON组细胞相比，CD59低表达的细胞中，p-AKT蛋白水平降低，p-STAT3蛋白水平降低，细胞内Notch1以及其靶基因HEY1的表达量下调，且变化有显著性差异（P<0.05）。CD59高表达的细胞中，p-AKT蛋白水平升高，p-STAT3蛋白水平升高，细胞内Notch1以及其靶基因HEY1的表达量上调，且变化有显著性差异（ P<0.05 ）。与CD59高表达细胞相比， CD59 W40位点突变的细胞 p-AKT蛋白水平降低， p-STAT3蛋白水平降低，细胞内Notch1以及其靶基因HEY1的表达量下调，且变化有显著性差异（ P<0.05 ）。BEZ235的添加有效的抑制了各组细胞中AKT的磷酸化。在CON组、W40组细胞中，BEZ235的添加上调了促凋亡蛋白Bax、Bim的表达，抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；在CD59过表达的细胞中，BEZ235的添加有效的阻碍了CD59过表达对促凋亡蛋白Bax、Bim的抑制作用，和对抗凋亡蛋白Bcl-2的促进作用。BEZ235的添加有效抑制了各组细胞中Notch1及其下游靶蛋白HEY1的表达。　　5、正常人群中ε3/ε3基因型最多，占检查人群比例的67.8%；ε2/ε4、ε4/ε4基因型的比例最少，均为0.7%；其他基因型ε2/ε3为16%，ε3/ε4为12.8%，ε2/ε2为1.1%。淋巴细胞白血病患者中ε3/ε3基因型分布最多，占检查人群比例的60%；ε2/ε4基因型分布最少，占2.5%。正常人群和淋巴细胞白血病患者ApoE基因多态性分布差异的统计学分析显示，ε2/ε2、ε3/ε3、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4五种基因型分布比率在两组比例中均有差异，但差异无统计学意义，ε4/ε4基因型分布比率在两组比较中的差异具有统计学意义。　　结论：　　1、CD59在急性T淋巴细胞白血病患者骨髓T淋巴细胞及淋巴瘤样本中高表达。Bcl-2和Bax可以作为淋巴瘤恶性转化的预测指标。Bcl-2的表达与淋巴瘤的恶性程度呈正相关作用，恶性程度越高，Bcl-2的表达越多。Bax的表达与淋巴瘤的恶性程度呈负相关作用，恶性程度越高，Bax的表达越少。　　2、本课题利用CD59稳定高表达，CD59稳定高表达但W40位点突变，CD59稳定高表达但K41位点突变的Jurkat细胞株发现了除抑制补体介导的细胞溶解作用外， CD59还具有通过促进IL-2分泌促进Jurkat细胞增殖，通过调节Bcl-2和Bax的表达抑制细胞凋亡的功能。在此过程中，W40位点是CD59发挥功能的关键性功能位点。　　3、本实验成功构建了急性T淋巴细胞白血病裸鼠模型。并在裸鼠模型中发现， CD59高表达抑制了外周血细胞、骨髓细胞和脾脏淋巴细胞的凋亡，促进了IL-2的分泌。这些结果提示CD59在将来可能成为淋巴细胞白血病治疗的靶点。　　4、在Jurkat细胞中，CD59可能会通过AKT信号途径调控Notch1及其下游靶基因的表达，或直接通过AKT或STAT3的激活，调节凋亡相关蛋白的表达，调控细胞凋亡，W40位点的突变会影响CD59与凋亡通路的相互作用。　　5、正常人群和淋巴细胞白血病人中ε3/ε3基因型最多。而且ε4/ε4基因型在淋巴细胞白血病人中的分布明显高于正常人群，其差异具有统计学意义。