紫杉二烯生物合成模块的构建与模块—底盘间的适配性研究

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天然化合物的生物合成是合成生物学的主要研究内容之一。萜类化合物是天然化合物的重要组成部分,在医药、能源领域都有着广泛的应用及发展前景。本文在合成生物学指导思想之下,利用酿酒酵母作为底盘细胞,构建二萜化合物紫杉二烯的人工合成细胞。紫杉二烯是一类二萜化合物衍生物。四分子异戊二烯基焦磷酸(IPP,5C)在相关酶的催化下先后生成牻牛儿基焦磷酸(GPP,10C)、法尼基焦磷酸(FPP,15C)、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP,20C),再经紫杉二烯合成酶环化生成紫杉二烯。本文克隆了N端截短的羟甲基戊二酰CoA基因(tHMGR)、转录因子UPC2编码基因的点突变等位基因UPC2.1,构建了鲨烯合成酶基因ERG9的下调元件,对酿酒酵母中负责IPP合成的甲羟戊酸(MVA)途径进行了优化,又引入人工合成的外源基因:紫杉二烯合成酶基因TS(短叶红豆杉来源),GGPP合成酶基因GGPPSsa(嗜酸热硫化叶菌来源)及GGPP合成酶基因CarG(三胞不拉氏霉菌来源),在酵母底盘内,人工构建了紫杉二烯生物合成模块,实现了紫杉二烯在酿酒酵母底盘中的生物合成。随后,本文利用酵母组装技术,对紫杉二烯生物合成途径中的必要基因进行重新设计组装,构建了依托单一CEN质粒的紫杉二烯生物合成模块。本文将实验所构建的多种紫杉二烯生物合成模块与不同的酵母底盘细胞进行适配,构建了多种紫杉二烯人工合成细胞,并对比了各个菌株在选择型合成培养基中发酵生产紫杉二烯的产量。本文使用的酵母底盘有W303、YSG50、BY4742及BY4742的单敲菌株YPL062W、YIL074C、YLR085C、YNL280C及YDR215C。实验结果显示酵母组装技术构建的单质粒紫杉二烯生物合成模块在各底盘细胞中均拥有较高紫杉二烯产量,并且在底盘YPL062W、YIL074C、YNL280C及YDR215C中的产量高于其他底盘,最高产量达到13.52mg/L。最后本文又选择了所构建的部分紫杉二烯人工合成细胞,使用YPD培养基进行发酵实验,实验结果中,包含单一CEN质粒模块的7株紫杉二烯人工合成细胞的发酵液中紫杉二烯的产量均有数倍提高,最高产量达到74.84mg/L。,远远超过现有文献报道的8.7mg/L。
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