人血清白蛋白是一种在医学上应用广泛，需求量大的蛋白质药物。而目前血浆提取生产的方式难以满足市场的要求，用基因工程方法生产人血清白蛋白无疑具有巨大的商业价值。由于巴斯德毕赤酵母表达系统自身的许多优点，使得其在表达外源蛋白中具有十分大的优势。本文的工作是用巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵纯化条件进行初步研究。在构建高产人血清白蛋白的基因工程菌时，采用了分泌型表达质粒pPIC9K构建成质粒pPIC9K-hsa。构建的质粒经线性化后电转化整合进入毕赤酵母GS115染色体AOX1基因中，通过MD/MM平板筛选出his+Muts型菌株。在此基础上，用G418平板筛选出高拷贝表达子。BMGY/BMMY摇瓶培养对不同的拷贝子进行筛选，发现随着拷贝子的增加表达量增加。其中菌株GS115-rHSA-8表达量最高。免疫印迹检测所表达的rHSA具有免疫原性。采用工业基础盐培养基，用摇瓶对发酵条件进行了实验研究。结果表明，组氨酸的加入量为0.15g/L时，蛋白表达量增加57.1%；加入0.10%体积比油酸时，蛋白量可增加43.4%；甲醇浓度控制在0.5％体积比左右时可以获得高产量，甲醇的加量超过1%体积比时，会<WP=4>对蛋白的分泌表达产生抑制，在2%时已经比较明显；甲醇诱导时添加甘油时可以提高产量，但当甘油添加量达到0.2%体积比时甘油已产生抑制表达作用；诱导表达时硫酸铵浓度为7g/L时蛋白浓度最高，高于9g/L时已开始出现抑制表达作用；改变培养时发酵液的pH为7.0，诱导表达时添加1.5%的YP(Yeast extract,5g/L; Peptone, 10g/L)均可以有效的控制rHSA的降解，而温度对蛋白的降解没有显著性影响。另外，添加100μm的PMSF也对降解有较好的控制作用，但因为毒性原因其安全性值得评价。经过初步探索，rHSA的纯化路线为：离心后上清液经60℃处理8h对蛋白酶灭活，冷至常温时离心除去热处理的变性蛋白；再经透析袋脱盐交换缓冲液，使得其条件为0.005mol/L， pH6.4的磷酸钠缓冲液；再将其上平衡后的DEAE Sephrose FF阴离子交换柱；然后以0.010mol/L，pH8.0的磷酸钠缓冲液加以0.10 mol/L，0.20 mol/LNaCl浓度进行梯度洗脱。该分离纯化路线对工业化路线有一定的参考价值，也对P. Pastoris表达的其它蛋白的纯化有一定的参考价值。