倍他米松(得宝松)对神经病理性疼痛大鼠模型的影响及分子机理研究 神经病理性疼痛是由中枢或外周神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征，它不同于由组织损伤而导致的急性疼痛，通常呈慢性、可持续数天或数月，而且常规的止痛药如阿片类强效麻醉性镇痛药及非甾体类抗炎药对它均无明显的疗效。神经病理性疼痛的临床起因广泛，病理机制复杂，症状多样。病理生理学特点主要表现为痛觉的高反应性，如痛觉过敏、痛觉超敏及自发疼痛等。临床上的传统药物主要以神经元细胞为靶点，而目前越来越多的文献指出神经系统的胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)及其释放的促炎细胞因子(肿瘤坏死因子α(TNF—α)、白介素-1(IL-1)、白介素—6(IL—6)等)在疼痛的激发和维持中发挥了不容忽视的作用，为人们研制预防和治疗临床疼痛的镇痛药物提供了一个全新的思路。 糖皮质激素用于临床疼痛治疗已有数十年的历史，但主要是铲对急性疼痛和部分慢性疼痛，较少使用在神经病理性疼痛的治疗中，相关机制研究也就更少，而且大部分的基础性研究也以经典的疼痛介质作为探讨机制的着眼点。得宝松(倍他米松)是目前国内使用较多的激素类镇痛药，对多种神经病理性疼痛都有一定镇痛效果，应用比较广泛。本研究通过脊髓腰5(L5)神经的结扎横切建立大鼠的神经病理性疼痛模型，研究了倍他米松对大鼠机械痛觉超敏和热痛觉过敏的影响，并从小胶质细胞及多种促/抗炎因子入手对其机制进行了初步探索。 第一部分 神经病理性疼痛模型的建立和相关机制的研究: 一．大鼠神经病理性疼痛模型的建立以及机械、热痛阈改变情况 从出生10～15周，体重250～300g的雄性大鼠中筛选出痛觉反应正常大鼠，按照Kim和Chung的方法通过脊髓腰5神经的结扎横切建立神经损伤模型，术后观察一般行为学情况，在术后第1、3、7、14和21天分别用von Frey法和Hargreaves 法测量机械缩足反射阈值和热缩足潜伏期。结果表明：脊神经损伤术后大鼠一般情况良好，出现了明显的机械痛觉超敏和热痛觉过敏表现，并在第3天达到高峰，证明大鼠神经病理性疼痛模型制作成功。 二．大鼠神经病理性疼痛模型相关机制的研究 (一)小胶质细胞在神经病理性疼痛大鼠脊髓的表达情况 大鼠脊神经损伤手术后第1、3、7、14、21天，完成机械和热痛阈测量后，多聚甲醛灌注处死动物，取脊髓L4-5节段用免疫组化方法观察脊髓小胶质细胞的表达活性。结果显示：免疫标记物OX-42标记阳性的小胶质细胞在正常脊髓后角表达较少，胞体较小，表面有小棘突和细长分支；手术后各时间点小胶质细胞明显增生，且分支变粗变长，呈阿米巴样分叉变形。通过细胞计数发现，术后小胶质细胞表达第3、7天达到高峰，随后逐渐减少，到第21天逐渐恢复术前水平，与大鼠的痛阈改变趋势类似。 (二)促/抗炎细胞因子在神经病理性疼痛大鼠脊髓及脑中的变化 脊神经损伤手术后第1、3、7、14、21天，完成机械和热痛阈测量后，处死动物，取整段脊髓组织(颈髓至骶髓)和全脑组织，用酶联免疫吸附法(ELISA)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测脊髓和脑组织中多种细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、前列腺素E2(PGE2)、干扰素-γ(IFN-γ)及白介素-10(IL-10)、白介素-4(IL-4)的表达情况。结果显示：与正常大鼠相比，术后脊髓、脑组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2表达显著增高，均在第3天达到最高峰(PGE2在术后第7天)，变化趋势与痛阈值变化一致；而抗炎因子IL-10、IL-4的表达则在术后逐渐增加，在第21天达到最高峰。 (三)核转录因子NF-kB在神经病理性疼痛大鼠脊髓及脑中的变化 大鼠行脊神经损伤手术后第1、3、7、14、21天，用凝胶电迁移法进行脊髓和脑组织核因子-kB(NF-kB)活性测定。结果显示：与正常大鼠相比，术后脊髓和脑组织中的NF-kB表达明显增加，并均在第3天达到最高峰，说明脊神经损伤手术可以诱导核转录因子NF-kB表达，并使其在整个实验过程中均保持较高的水平。 第二部分 倍他米松对神经病理性疼痛大鼠模型影响的相关机制研究: 一．倍他米松对神经病理性疼痛大鼠模型的影响 将行L5脊神经损伤术的实验动物随机分为四组：(1)硬膜外腔注射得宝松组， (2)硬膜外腔注射生理盐水组，(3)损伤局部注射得宝松组，(4)损伤局部注` 射生理盐水组。结果显示：与生理盐水组相比，在术后三周各时间点两组得宝松均能显著提高大鼠的机械和热痛阈值，明显减轻机械痛觉超敏和热痛觉过敏表现，表明得宝松的局部注射和硬膜外腔注射途径均能缓解大鼠的疼痛行为学表现。 二．倍他米松对神经病理性疼痛大鼠模型影响的相关机制研究 (一)倍他米松对小胶质细胞在神经病理性疼痛大鼠脊髓表达的影响 通过免疫组化方法观察不同给药组L4-5节段小胶质细胞的表达情况。结果显示：各组动物脊神经损伤术后OX—42标记阳性的小胶质细胞均显著增生，胞体肥大、分支增多呈树叉样，主要分布于手术侧脊髓后角的灰质之中；与生理盐水注射组相比，得宝松注射组中小胶质细胞表达含量均明显减少，分别在术后第3天(损伤局部注射组)和术后第7天(硬膜外腔注射组)达到最高峰，至术后第21天逐渐恢复接近正常水平。 (二)倍他米松对促/抗炎细胞因子在神经病理性疼痛大鼠脊髓及脑中表达的影响 分别运用RT—PCR和ELISA的方法检测了不同给药组大鼠在脊神经损伤术后第1、3、7、14和21天，脊髓和脑组织的TNF—α、IL-1β、IL—6、PGE2及IL-10、IL—4的表达情况。结果显示：与生理盐水组相比，两组得宝松均能显著抑制术后各时间点脊髓和脑组织中的促炎因子TNF—α、IL-1β、IL—6、PGE2水平；同时得宝松可显著刺激抗炎因子IL-10、IL—4的表达，在术后第21天达到高峰。 (三)倍他米松对NF—κB在神经病理性疼痛大鼠脊髓及脑中表达的影响 检测不同给药组大鼠在脊神经损伤术后第1、3、7、14和21天，脊髓和脑组织的NF—κB活性变化情况。结果显示：与生理盐水组相比，两组得宝松均能显著抑制术后各个时间点脊髓和脑组织中NF—κB的活性，变化趋势与大鼠痛阈改变趋势相一致。 结 论: 本研究中通过L5脊神经损伤手术建立大鼠的神经病理性疼痛模型，研究倍他米松(得宝松)对大鼠机械和热痛觉敏感程度的影响，并检测了与疼痛相关的NF—κB、多种促/抗炎因子和小胶质细胞的表达情况，对其作用机理进行了探讨。 研究发现小胶质细胞及其释放的炎性介质在痛觉超敏和痛觉过敏的形成和发展中发挥了一定的作用，中枢神经系统的神经炎症和神经免疫反应参与了病理性疼痛的调节过程；而倍他米松(得宝松)损伤局部及硬膜外腔注射能预防大鼠神经病理性疼痛的形成，这可能与其抑制中枢神经系统的小胶质细胞表达、NF—kB活性、促炎因子含量及上调抗炎因子水平有关，为临床用药提供了实验依据。