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我国淡水珍珠产量自上世纪80年代初以来一直处于世界领先地位,三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是最主要育珠蚌。三角帆蚌所产珍珠珠质光滑细腻,颜色鲜艳多样。珍珠颜色影响珍珠价值。珍珠颜色受到供片蚌珍珠层颜色的影响。外泌体参与贝壳形成,外泌体是否参与贝壳珍珠层颜色形成值得关注。本研究以实验室构建的三角帆蚌紫色(贝壳珍珠层为紫色)与白色(贝壳珍珠层为白色)家系为实验材料,通过miRNA与蛋白质组测序技术对外套膜外泌体在贝壳珍珠层颜色形成过程中的作用进行了研究。主要结果如下:1.三角帆蚌白色与紫色家系外套膜外泌体提取、鉴定及miRNA表达谱分析首次成功提取三角帆蚌白色与紫色家系外套膜外泌体。使用电镜鉴定外泌体形态为茶托样,粒径分布分析表明白色与紫色家系外泌体直径分别为175.2±5.1 nm及176.1±5.4nm。对两种外泌体small RNA文库进行高通量测序与表达谱分析。通过与miRbase V21数据库比对,在白色与紫色家系外套膜外泌体中分别获得了136个与159个miRNA。使用|log2(Fold change)|≥2,且 p value≤0.05 的标准,获得了 54个差异表达miRNAs,其中15个在白色家系外泌体中高表达,39个在紫色家系外泌体中高表达。预测调控三角帆蚌珍珠层颜色形成相关基因差异表达miRNAs,对这些miRNAs进行qPCR验证,结果发现miRNAs的表达量与测序结果一致。2.外泌体miRNA对三角帆蚌珍珠层颜色形成相关基因的调控作用软件预测miR-15b可能靶向调控三角帆类胡萝卜素代谢相关基因hcApo,该基因参与珍珠层颜色形成。使用双荧光素酶报告基因实验发现miR-15b能够抑制hcApo的表达。将36只蚌分为3组分别注射miR-15b antagomir、阴性对照、1×PBS后,使用β-胡萝卜素对每组一半的蚌进行投喂发现,miR-15b antagomir能够抑制肝胰腺、鳃、边缘膜和中央膜中miR-15b的表达,并且hcApo的表达量上升。投喂β-胡萝卜素后,hcApo组织表达量增加。在miR-15b antagomir与β-胡萝卜素双重作用下hcApo基因表达量最高。结果表明miR-15b能够负调控hcApo基因表达,参与三角帆蚌珍珠层颜色形成。软件预测miR-4504可能靶向调控三角帆蚌黑色素合成相关基因HcMitf,该基因参与珍珠层颜色形成。使用双荧光素酶报告基因实验发现miR-4504能够抑制HcMitf的表达。将27只蚌分别注射miR-4504 antagomir、阴性对照、1×PBS发现,miR-4504 antagomir能够抑制边缘膜、中央膜、鳃、斧足、肝胰腺和肾脏中miR-4504的表达,HcMitf的表达量与下游酪氨酸酶基因HcTyr的表达量均显著上升。注射miR-4504 antagomir后,三角帆蚌边缘膜与中央膜中酪氨酸酶活性与黑色素的含量显著增加。以上研究表明miR-4504能够通过调控HcMitf基因参与三角帆蚌黑色素合成,影响珍珠层颜色形成。3.三角帆蚌白色与紫色家系外套膜外泌体蛋白质组学分析对三角帆蚌白色与紫色家系外套膜外泌体进行蛋白质TMT(串联质量标签)定量测序分析,总共获得了 4861个蛋白。对这些蛋白进行功能注释分析(GO、COG、KEGG以及结构域注释)发现了一些已经被报道的参与贝壳形成与珍珠层颜色形成的相关蛋白。使用|log2(Fold change)|≥2或≤0.83,且p value≤0.05的标准,获得758个差异表达蛋白(396个在紫蚌外泌体中高表达,362在白蚌外泌体中高表达)。随机挑选14个差异表达蛋白,进行平行反应监测(PRM)实验,结果与测序结果一致。对差异表达蛋白进行GO富集分析发现,金属离子(例如Fe、Cu、Zn、Mn、Mg等)结合GO term富集到最多的差异蛋白,其次是碳水化合物代谢(多糖)GO term。对差异蛋白进行KEGG富集分析发现,新陈代谢通路富集到较多的差异蛋白,但是富集程度较低。矿物质吸收这一通路差异蛋白富集数量虽然不多但是富集程度最高,该通路包含了 3个铁代谢相关蛋白。综合富集分析结果发现,铁元素与珍珠层结构差异可能导致贝壳珍珠层颜色的差异。4.三角帆蚌珍珠层颜色相关基因克隆与表达分析根据蛋白质组测序分析结果,对三角帆蚌中铁蛋白从基因水平进行研究。克隆三角帆蚌铁蛋白基因HcFerritin,基因全长2435bp,编码了 172个氨基酸,包含一个真核铁蛋白结构域。组织定量结果显示HcFerritin基因在所有组织(边缘膜、中央膜、闭壳肌、鳃、斧足、肝胰腺以及血液)均有表达,鳃中表达最高。对比分析发现三角帆蚌紫色家系中边缘膜、中央膜中基因表达量显著高于白色家系。原位杂交结果发现HcFerritin基因在外套膜外褶背膜上皮细胞中有明显阳性杂交信号。对三角帆蚌进行铁离子胁迫实验发现,铁离子可以诱导HcFerritin基因表达。对三角帆蚌粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因HcCPOX进行克隆,全长1477bp,编码397个氨基酸,包含一个Coprogen-oxidas结构域。组织定量结果表明HcCPOX基因在所有组织均有表达,鳃中表达最高。对比分析发现三角帆蚌紫色家系中除了中央膜其它组织HcCPOX表达量均显著高于白色家系。原位杂交结果表明,HcCPOX基因主要在外套膜外褶背膜上皮细胞中出现明显阳性杂交信号。对边缘膜、鳃、斧足、血液组织进行卟啉原Ⅲ氧化酶活性检测发现,紫色家系边缘膜、鳃和斧足组织中粪卟啉原Ⅲ氧化酶活性均显著高于白色家系。RNA干扰实验中,鳃、边缘膜、斧足、血液中HcCPOX的表达量被抑制,组织中卟啉原Ⅲ氧化酶活性也出现了一定程度的抑制。