研究背景:因严重创伤、骨肿瘤切除和骨髓炎清创术后出现的长管骨大段骨缺损一直以来是骨科领域治疗的难点。长管骨大段骨缺损导致的骨不连和其他并发症往往会造成肢体残疾等严重后果,给患者造成巨大的痛苦和沉重的经济负担。目前临床治疗长管骨大段骨缺损的手段中,自体骨移植仍是金标准。但在骨缺损范围较大的情况时,由于自体骨的来源有限,往往难以获得足够的移植骨,而且大量的自体取骨常会出现许多并发症,包括神经和血管损伤、感染、供骨区慢性疼痛等等。除了自体骨移植,一些其他手段也被应用于长管骨大段骨缺损的修复和治疗,包括Ilizarov技术、Masquelet技术和骨组织工程等方式。不过目前以上几种方式都存在一定的不足,Ilizarov技术需要较为复杂的外固定器械,且在牵张成骨过程中因软组织局部的压力,往往造成患者肢体的持续疼痛,并且伴随着力线偏移、针道感染和神经损伤的风险。Masquelet技术在其治疗的第一阶段通过植入PMMA形成诱导膜,在治疗的第二阶段仍然依赖于自体骨移植。另外Masquelet技术治疗周期漫长,也增加了治疗过程中的不确定性。骨组织工程技术是近年来研究的热点之一,骨组织工程所需的最主要三种生物学要素包括种子细胞、细胞外基质支架和促进生长、分化和血管生成的细胞因子。尽管发展迅速,但目前为止尚无一种最佳材料可以完全解决长管骨大段骨缺损的治疗问题。骨折愈合是一个复杂的生物学过程,其中包含诸多成骨要素,其中任何一个环节受到损害,都有可能使骨折愈合过程受阻,并最终形成骨不连。长管骨大段骨缺损由于局部缺乏骨质和血运,如果在一期治疗无法形成骨愈合,多导致形成萎缩性骨不连。所以长管骨大段骨缺损的治疗,需尽可能使其在一期实现骨愈合,避免骨不连的发生,减少患者痛苦,并提高患者的生活质量和肢体功能。Masquelet技术的膜诱导成骨机制激发了本课题组的的浓厚兴趣,本课题尝试基于这项技术的基本原理和操作,在此基础上进行进一步的探索和改进,以获得一种更为优良的骨诱导技术。同时,探究是否能够不依靠骨移植和种子细胞,单纯使用一种新型的诱导技术来修复长管骨大段骨缺损。目前硅橡胶材料已经广泛应用于生物医学相关领域,包括乳房假体、医用导管和口腔医学等领域,显示出良好的安全性。在周围神经再生研究中,一些研究者使用硅橡胶管套接,用于诱导神经再生,并且得到了良好的效果。但硅橡胶材料用于诱导治疗长管骨大段骨缺损目前尚无文献报道。本课题组基于Masquelet技术的原理和硅橡胶管诱导神经纤维再生的启发,开发了一种全新的骨诱导方法,尝试使用硅橡胶密闭通道,用于诱导修复长管骨大段骨缺损,并设计了相关的体内和体外实验。研究目的:本课题拟通过体内和体外实验,证明硅橡胶密闭通道诱导修复兔长管骨大段骨缺损的有效性,并对其成骨过程和机制进行探究。研究方法:1.分离、培养SD大鼠BMMSCs,并对提取细胞进行鉴定。2.设计体外实验,利用提取的BMMSCs,验证硅橡胶材料的生物相容性和长期植入体内的可行性。3.设计体内实验,建立兔桡骨大段骨缺损模型,手术植入硅橡胶密闭通道进行诱导。在术后1天、3天、7天、14天、4周、8周、12周和16周八个时间点进行取材,探究硅橡胶密闭通道诱导修复长管骨大段骨缺损的有效性。并通过X线、Micro CT、骨组织荧光标记和病理染色等方式,进一步阐释硅橡胶密闭通道诱导成骨的过程。研究结果:1.本课题成功提取了SD大鼠的BMMSCs,并以此为基础通过体外实验证明,医用硅橡胶材料在细胞毒性、溶血反应、细胞粘附性和对骨髓间充质干细胞的成骨能力影响等方面,均符合植入标准,作为一种植入体内的成骨诱导材料具有可行性。2.本课题通过体内实验证明了,硅橡胶密闭通道可以诱导兔长管骨大段骨缺损的修复和再生,这一过程是一个软骨内成骨的过程。诱导成骨的初始阶段,密闭硅橡胶通道内形成血肿组织,并形成骨缺损断端的桥接。新生血肿组织中富含成骨相关蛋白、成血管相关蛋白和TGF-β1等因子。随后血肿组织逐渐出现血管化和软骨内成骨,最终软骨组织被成熟骨组织替代完成骨愈合,新生骨组织具有良好的血运。这种诱导方式依赖于硅橡胶通道完整密闭的环境。结论:本实验通过体外和体内实验证明,医用硅橡胶材料具有良好的生物相容性,硅橡胶密闭通道可以诱导修复兔长管骨大段骨缺损,实现骨再生。在本实验中这一过程不依赖植骨,并可以实现骨愈合。硅橡胶通道诱导成骨的过程是一个软骨内成骨过程,早期形成的血肿组织富含成骨和成血管相关蛋白,并逐渐发生血管化和软骨内成骨反应,最终实现骨的再生。在这一诱导过程中,成功的关键因素在于硅橡胶通道的完整密闭环境。这种新的骨诱导方法,为未来临床治疗长管骨大段骨缺损提供了新的思路。本研究创新点:1.本研究首次提出了“硅橡胶密闭通道诱导修复长管骨大段骨缺损”的方法。用密闭硅橡胶通道连接骨缺损的两端,在局部创造密闭环境,避免了纤维组织长入干扰骨组织的再生,有效避免了骨不连的发生。实验结果显示硅橡胶材料本身不能直接诱导BMMSCs成骨矿化,这进一步说明:诱导成骨关键因素是通道的密闭环境,而不是材料直接诱导成骨。2.本实验使用的骨诱导方法和以往的Masquelet技术相比,最主要的优势在于治疗过程不需要植骨。本实验不同于骨组织工程技术,不使用种子细胞和复杂的合成材料,目的是提出一种全新的骨诱导方法和成骨理念。3.本实验中使用的骨缺损模型,缺损长度超过4.5倍骨直径,在同类实验中属于较长节段,这说明本诱导方式具有良好的诱导成骨效果。研究结果揭示了“硅橡胶密闭通道诱导修复长管骨大段骨缺损”的发生机制是一个软骨内成骨的过程。密闭通道内早期形成血肿组织,并在骨缺损两端形成桥接,新生血肿组织中富含成骨相关蛋白、成血管相关蛋白和TGF-β1等因子,可有效诱导成骨。这种诱导方式依赖于硅橡胶通道完整密闭的环境。