第一部分新型二价高血压疫苗的构建目的:高血压的临床治疗往往需要针对多靶点联合用药,而现有的高血压疫苗仅针对单一治疗靶点。为了研制更具有应用潜力的高血压疫苗,我们将探索构建针对两种不同靶点的新型二价高血压疫苗。方法:将分别来源于人血管紧张素II受体1型和L型钙通道的短肽抗原表位插入经过修饰的乙型肝炎病毒核心抗原（HBc Ag）的免疫优势区,构建重组蛋白。重组蛋白由大肠杆菌系统表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对表达产物进行鉴定。表达产物经过包涵体复性和蛋白质纯化等步骤后可获得重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10。采用透射电子显微镜观察重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10的形态结构。另外采用化学偶联技术分别制备针对人血管紧张素II受体1型和L型钙通道的短肽抗原的化学偶联疫苗,分别免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备分别针对人血管紧张素II受体1型和L型钙通道的单克隆抗体。将重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10分别与上述单克隆抗体以及商业化的针对HBc Ag的抗体结合,以检测外源表位在重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10表面的展示情况。结果:构建的重组蛋白可以在大肠杆菌系统中高效表达,主要以包涵体形式存在于表达产物中。经过包涵体复性和蛋白质纯化后,可以制备得到重组蛋白。并且重组蛋白可自我组装形成直径约30纳米的空心球形病毒样颗粒。分别采用针对人血管紧张素II受体1型和L型钙通道的单克隆抗体以及商业化的针对HBc Ag的抗体与重组病毒样颗粒结合,发现重组病毒样颗粒与针对外源表位的单克隆抗体结合良好,但是与商业化的针对HBc Ag的抗体结合不佳。结论:成功地以HBc Ag病毒样颗粒为基础构建了一种重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10,这种重组病毒样颗粒能同时良好地展示插入的两种外源表位,有望成为一种新的二价高血压疫苗。第二部分新型二价高血压疫苗的有效性研究目的:我们研制了一种新型二价高血压疫苗,在本研究中,我们将利用这种疫苗免疫高血压动物模型,以探究二价疫苗的免疫原性,并且探究二价疫苗对于高血压动物模型高血压的治疗效果。进一步地,我们对动物模型给予L-NAME诱导肾脏损伤,以研究二价疫苗对于L-NAME诱导的肾脏损伤的保护作用。方法:（1）在第一个高血压动物模型中,将自发性高血压大鼠随机分成空白对照组、L-NAME组、L-NAME+Qβ-CQ10疫苗组、L-NAME+Qβ-CE12疫苗组、L-NAME+氨氯地平+缬沙坦组、L-NAME+二价疫苗组。各疫苗组分别于第0、14、28、56、84、98天给予相应疫苗免疫,L-NAME+氨氯地平+缬沙坦组从第14天开始灌胃给予氨氯地平和缬沙坦,对各L-NAME处理组在第84天至112天在其饮用水中添加L-NAME。定期采用无创鼠尾血压计测定各实验动物血压和心率,并且定期通过ELISA测定各实验动物血清中的抗体滴度。实验结束前,通过代谢笼收集动物尿液,测定24小时尿蛋白含量。实验结束后,取动物肾脏进行Masson染色和透射电子显微镜观察,分析动物肾脏病理改变。同时取动物血清样品,测定动物血清肌酐、尿素氮水平。（2）在另一个高血压动物模型中,将BALB/c小鼠随机分成空白对照组、Ang II组、Ang II+氨氯地平+缬沙坦组、Ang II+二价疫苗组。Ang II+氨氯地平+缬沙坦组从第14天开始灌胃给予氨氯地平和缬沙坦,疫苗组分别于第0、14、28天给予二价疫苗免疫。各Ang II处理组小鼠于第15天在无菌条件下皮下植入充满Ang II的胶囊给药泵,造成高血压模型。定期检测各实验动物的血压、心率、以及血清中抗体滴度。结果:（1）二价疫苗免疫自发性高血压大鼠后,成功诱导产生了分别针对血管紧张素受体和L型钙通道的特异性抗体,同时二价疫苗免疫有效降低了自发性高血压大鼠的收缩压,最大降幅为25mm Hg。并且加强免疫后,二价疫苗引起的降压效应与化学偶联疫苗引起的降压效应相比,血压降幅具有一定优势。（2）在Ang II诱导的高血压小鼠模型,二价疫苗同样诱导产生了分别针对血管紧张素受体和L型钙通道的特异性抗体,同样有效降低了BALB/c小鼠的收缩压,最大降幅为35mm Hg。（3）经过L-NAME处理后,小部分自发性高血压大鼠出现了死亡,二价疫苗组大鼠死亡率略微低于L-NAME组,但差异不具有统计学意义。对各组大鼠肾脏病理变化进行分析发现,二价疫苗能有效减轻L-NAME造成的肾脏纤维化和肾小球基底膜增厚。此外,二价疫苗也有效缓解了L-NAME造成的血清肌酐、尿素氮、以及24小时尿蛋白水平的升高。结论:二价疫苗能诱导产生分别针对血管紧张素受体和L型钙通道的特异性抗体,能有效降低高血压动物模型的血压,相比针对单一靶点的疫苗具有一定的优势;同时二价疫苗能有效减轻L-NAME造成的肾脏损害。第三部分新型二价高血压疫苗的安全性研究目的:我们研制的二价高血压疫苗可诱导产生针对治疗靶点的特异性抗体,并且能有效降低高血压动物模型的血压,我们将从不同角度评估二价疫苗的安全性。方法:（1）在第二部分以自发性高血压大鼠模型为研究对象的实验结束前,用超声仪检查各实验动物心功能;这部分实验结束时,分别收集实验动物的心脏、肾脏、肝脏、肺,进行病理染色,观察各组织器官有无明显炎症细胞浸润。另外将肾脏进行透射电子显微镜观察,注意观察肾小球基底膜和系膜区有无电子致密物沉积。（2）在另一项研究中,将7周龄雄性BALB/c小鼠随机分成三组:即Day 0组、Day 7组、Day 21组。在第0天分别给予各组小鼠200微克二价疫苗皮下免疫,随后于当天处死Day 0组小鼠,第7天处死Day 7组小鼠。第14天给予Day 21组小鼠200微克二价疫苗皮下免疫,于第21天处死Day 21组小鼠。处死小鼠后,分别收集脾脏和血清。采用流式细胞术检测小鼠脾脏中淋巴细胞分化情况,用ELISA试剂盒检测小鼠血清中产生的Ig G抗体亚型。（3）分别制备并培养稳定表达h ERG钾离子通道和NaV1.5钠离子通道的HEK293细胞系,利用针对L型钙通道的单克隆抗体分别与上述细胞共孵育,用膜片钳技术检测该单克隆抗体分别对h ERG钾离子通道电流和NaV1.5钠离子通道电流的影响。结果:心脏超声检测结果显示,二价疫苗不影响动物的心功能。各主要组织器官病理染色没有发现明显的炎症细胞浸润,肾小球基底膜和系膜区也没有发现免疫复合物沉积。二价疫苗免疫后,小鼠脾脏中Th1细胞的分化明显降低,Tfh细胞的分化显著增加,并且小鼠血清中主要产生Ig G1型抗体。膜片钳实验结果表明,针对L型钙通道的单克隆抗体对h ERG钾离子通道电流和NaV1.5钠离子通道电流没有明显影响。结论:二价疫苗免疫后,各主要组织器官没有发生明显炎症反应,主要诱导针对治疗靶点的体液免疫应答,并且发生恶性心律失常的可能性较低,总体安全性良好。