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多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid, PUFAs)是细胞结构和功能的重要组成部分,其中γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid, GLA)在预防糖尿病,皮肤病等疾病中有重要作用。深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)是一种重要的GLA产生菌,对其进行改造得到高产菌株,以及建立一套高效稳定的遗传转化体系对其脂肪酸代谢机制进行研究有重要的意义。本研究根据根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导T-DNA转化真菌引起插入突变的原理,建立了深黄伞形霉的高效遗传转化体系,为深黄伞形霉的功能基因组学研究以及筛选高产工业用菌株奠定了基础。
1.对进行深黄伞形霉遗传转化的关键条件与因素进行筛选和优化。结果表明：农杆菌R105转化深黄伞形霉的效率明显高于菌株LBA4404和EHA105;带有高山被孢霉(Mortierella alpina)H4启动子的pBI/hph质粒的转化效率要明显高于带有构巢曲霉(Aspergillus nidulans) trpC(N-(59-phosphoribosyl)anthranilateisomerase)启动子的pBI/hphII质粒,原因可能为高山被孢霉与深黄伞形霉的同源性较强；共培养前对农杆菌用IM液体培养基(AS 200 μ m/ml)诱导至OD600为0.8-1.0,深黄伞形霉孢子浓度为1×106个/ml,将其等体积混合后每皿涂200μl混合液,在24℃共培养48h转化效果最理想,可获得50-100个转化子。这是对于农杆菌R105介导的真菌遗传转化的首次报道。
2.利用优化好的深黄伞形霉遗传转化体系对其进行遗传转化实验和转化质量检验。结果表明：平均每1×106个深黄伞形霉孢子可得到50-100个抗潮霉素克隆；从获得的深黄伞形霉抗潮霉素克隆中随机抽样,以质粒PD4中潮霉素磷酸转移酶基因编码区设计了一对引物(hph1, hph2)进行PCR检测,结果参试克隆均扩增到819 bP的片段,初步表明用ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation)遗传转化体系进行深黄伞形霉的遗传转化结果的假阳性率较低。在无潮霉素选择压力的PDA培养基上连续转接培养6代后,87.5％转化子的抗潮霉素表型仍然保持稳定,说明该方法得到的转化子较为稳定。在获得的插入转化子中,随机抽样进行Southern blot,结果发现hph(hygromycin resistance gene)基因已经成功插入到了深黄伞形霉基因组中去,但是单拷贝插入率较低。 3.利用根癌农杆菌介导T-DNA插入深黄伞形霉高效转化体系获得了大量T-DNA插入转化子。发现用ATMT得到的深黄伞形霉转化子形态与原始菌株差异不大。检测了其中115株的产脂肪酸量,发现绝大部分的突变株出现了生长状况缓慢,产油量降低的现象,约占到总数的60.8％；而有部分突变株的产油量同M6-22原始菌株差别不大,这部分大约为总数的33.4％；而只有6株出现了产脂肪酸量上升的情况。通过GC分析表明M-mut22与M-mut64的脂肪酸成分与原始的M6-22菌株并没有差异,但是M-mut64的GLA含量明显上升。