研究背景麻黄汤是中医治疗风寒表实证的经典方剂,在临床中应用广泛。其中,麻黄和桂枝是发挥药效的主要药味,在原方中的配伍比例为3：2。大量的实验研究表明,麻黄-桂枝配伍可以增强药物的发汗作用,缓解患者的发热、鼻塞、咳喘等症状。中药麻黄来源于麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf中麻黄Ephedra intermedia Schrenk et C. M. Mey.或木贼麻黄Ephedra equisetina Bge.的干燥草质茎。麻黄类生物碱是麻黄的主要有效成分,含量为0.5-2.5%。其中,麻黄碱占30-90%。麻黄在中国历史上使用时间长久,可用于治疗各种呼吸系统疾病。并且,无论在临床应用中还是病例文献报道上都很少有关于过量使用麻黄造成毒副作用的记录。《中国药典》一部(2010年版)也未将麻黄列入具有毒性的中药材。这表明在中医理论指导下合理使用麻黄是相对安全的。然而,现在西方国家不断有病例文献报道,过量或长期使用麻黄容易引起明显的毒副作用。麻黄碱是苯丙胺类生物碱,在药理作用上与右旋苯丙胺和甲基苯丙胺相似。它是一种中枢神经系统兴奋剂,可以引起失眠、精神不安、颤动及焦虑。长期大剂量使用麻黄碱可能会造成严重的神经系统疾病,比如妄想症、幻觉及其它精神障碍。有文献报道称,长期使用麻黄可以造成死亡。我们前期研究发现,长期灌胃给予大鼠麻黄提取物可以造成明显的神经细胞凋亡。其中,额叶皮层是毒性反应最为敏感的脑区。桂枝来源于樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝。《中国药典》一部(2010年版)将桂皮醛作为中药材桂枝的质量监控指标。文献研究表明,桂皮醛具有镇静、抗氧化和抑制神经细胞炎症反应的作用。并且,桂枝提取物中的其它一些成分也具有类似的神经保护作用,例如香豆素类等。鉴于桂枝提取物具有显著的神经保护作用,我们推测麻黄-桂枝配伍使用时,桂枝可能表现出类似的神经保护作用,尤其是对于额叶皮层区域。复方是中医药的重要组成部分和应用形式。药对通常有两味中药组成,是最简单的复方配伍形式。《伤寒论》和《金匮要略》中记载有大量的药对配伍。根据配伍的作用,可以分为单行、相须、相使、相畏、相杀、相恶、相反等,也叫“七情合和”。但是,在文献古籍中记载最多、应用最广泛的是相须配伍。相须是指性能功效相类似的两味中药配伍使用(一般只讨论两味中药之间,当然也可以多种),可以增强某种或几种治疗效应,增强治疗作用。也就是相对于单独使用其中一味中药,药对配伍可以增强其功效,增强的功效可能是一种也可能不止一种。麻黄-桂枝药对在麻黄汤原方中就是经典的相须配伍使用的药对。有关麻黄-桂枝药对的相须作用,前人已经做了大量的研究工作。但是,由于麻黄的毒副作用,目前麻黄的使用只能由具备医师资格的专业人员开具处方。然而,我们认为麻黄-桂枝药对配伍除了具有相须作用外,可能还存在相杀的作用。这也可能是麻黄作为中药在临床使用中相对安全的一个重要原因。研究目的“七情合和”是中药配伍的基本理论。药材之间存在着潜在的协同或制约合和关系,除不能配伍使用的相反、相恶外,这些关系被分解为相须、相使、相畏、相杀。药对配伍受药材性味、归经、功效的影响,其中剂量和配比是关键的影响因素,量的渐变可引起药材相互关系的质变。我们课题组在中医理论指导下,以麻黄作为研究对象,对麻黄及麻黄类药对、复方进行了长期大量的实验研究工作,掌握了其相关毒理学、药理学、药动学、药代学的一些规律。前期实验结果表明,麻黄可以影响动物的中枢神经功能,出现兴奋性行为变化。进一步研究表明,麻黄对中枢神经系统的作用与其影响氨基酸类神经递质释放有关。麻黄可以上调兴奋性氨基酸类神经递质的释放,减少抑制性神经递质释放的比例,麻黄碱是其作用的主要成分。麻黄与桂枝配伍使用后,桂枝可以拮抗麻黄引起的兴奋性行为学差异,调节氨基酸神经递质的释放,减弱麻黄引起的兴奋性中枢神经毒性。本研究在前期工作的基础上,为进一步揭示桂枝的中枢神经系统保护作用,验证麻黄-桂枝配伍使用的合理性,减少麻黄临床应用的不良反应,特作以下研究。研究方法根据前期实验结果发现,以SD大鼠作为研究对象,6g/kg是麻黄灌胃给药的有效剂量,15g/kg是毒性成分变化的敏感剂量。在此基础上,以略高于有效剂量作为麻黄毒理给药剂量的低剂量,等比设置低、中、高剂量组(7.5、15、30g/kg)。根据麻黄汤的原方配比,分别设置麻黄-桂枝3：1组、麻黄-桂枝3：2组、麻黄-桂枝3：4组。按桂枝与麻黄配比的不同,设置桂枝单味给药的高、中、低剂量组。另设生理盐水空白对照组和麻黄碱阳性对照组,则本实验共涉及动物给药组11组,每组动物6只。本课题的实验动物购自南方医科大学实验动物中心,许可证号：SCXK(粤)2011-0015。1麻黄-桂枝药对配伍对麻黄碱体外溶出的影响及动物给药剂量的确定建立HPLC测定水提液中麻黄碱含量的方法,并进行方法学考察。分别测定单味麻黄和麻黄-桂枝配伍组(3：1,3：2,3：4)水提液的麻黄碱含量,考察药对配伍对体外麻黄碱溶出的影响。在此基础上,以水提液中麻黄碱含量作为量化指标,进一步通过浓缩和稀释等手段,使不同组别供试药的麻黄碱含量保持一致,确定动物实验的给药剂量。2麻黄-桂枝药对配伍对SD大鼠行为学的影响分别灌胃(ig)给予大鼠生理盐水和各剂量供试药,记录大鼠在ig前及ig后1、2、4、6、8h时5min内的活动情况。实验过程中观察记录大鼠的行为变化。通过考察SD大鼠灌胃给药后8h内的行为学参数变化,考察不同剂量麻黄、桂枝和麻黄-桂枝配伍组(3：1,3：2,3：4)对中枢神经系统的作用。采用戊巴比妥钠睡眠试验,分别灌胃(ig)给予大鼠生理盐水和各剂量供试药。给药45min后各组分别腹腔注射(ip)2%戊巴比妥钠40mg/kg,观察大鼠睡眠情况,记录睡眠潜伏期、睡眠持续时间。麻醉后20min,用手触摸左右眼睫毛观察睫毛反射；用针刺激实验动物腿部肌肉观察刺痛反应。采用高架桥试验,分别灌胃(ig)给予大鼠生理盐水和各剂量供试药。ig后1h时将大鼠从中央格面向闭合臂放入迷宫,记录5mmin内的活动情况。观察开放臂进入次数(必须有两只前爪进入臂内)(open arm entry, OE),开放臂停留时间(open arm time, OT),闭合臂进入次数(close arm entry, CE)。计算开放臂进入次数比例及总进入次数。采用旷场试验,分别灌胃(ig)给予大鼠生理盐水和各剂量供试药,每天一次,连续ig7天。每次给药后,记录大鼠在ig后1h时5min内的活动情况,计算每天的总运动路程。考察大鼠首次给药的跨格数(水平得分)、站立次数(垂直得分)、总运动路程、区域停留时间等相关参数。3麻黄-桂枝药对配伍对大鼠额叶皮层的组织结构及氧化应激相关指标的影响分别灌胃(ig)给予大鼠生理盐水和各剂量供试药,连续ig7天。末次灌胃给药结束后,开颅取脑。一部分放入盛有10%中性甲醛的瓶中固定,常规脱水、透明、石蜡包埋,冠状切片,每张切片厚3um,选取含额叶皮层的切片进行HE染色,考察不同剂量麻黄、桂枝和麻黄-桂枝配伍组(3：1,3：2,3：4)对大鼠额叶皮层的组织结构的影响；另一部分放于冷冻的生理盐水中漂洗,研磨匀浆后,采用生物试剂盒测定额叶皮层组织的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。4麻黄-桂枝药对配伍对大鼠额叶皮层组织中麻黄碱含量及氨基酸类神经递质释放的影响建立UPLC-ESI-MS/MS测定大鼠额叶皮层组织样品中麻黄碱和谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、天冬氨酸(Asp)及甘氨酸(Gly)等氨基酸类神经递质含量的方法,并进行方法学确证。在此基础初上,分别灌胃(ig)给予大鼠生理盐水和各剂量供试药,连续ig7天,测定额叶皮层组织中麻黄碱的蓄积情况和氨基酸类神经递质的含量变化,考察染毒不同时期麻黄碱对大鼠额叶皮层氨基酸类神经递质释放的作用,以及药对配伍对其作用的影响。5 PK-PD联合模型法研究麻黄-桂枝药对配伍对大鼠中枢神经系统的作用建立UPLC-ESI-MS/MS测定大鼠血液透析液和脑透析液样品中麻黄碱含量及脑透析液中谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)等氨基酸类神经递质含量的方法,并进行方法学确证。借助微透析采样技术,以麻黄碱在大鼠血液和脑脊液中的浓度变化为药动学观察指标(PK),以氨基酸类神经递质的动态变化为药效学指标(PD),科学地阐明麻黄碱在大鼠额叶皮层的浓度-效应-时间三维关系,拟合药物浓度及其效应经时过程的曲线,考察药对配伍对麻黄碱体内药代动力学和药效动力学的影响。6统计学处理运用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±SD)表示。多组之间主要药效学参数的均数比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA);第二章中的重复测量数据采用重复测量资料的方差分析；麻黄与桂枝间的交互作用及第四章的测量数据采用析因方差分析；双侧检验P<0.05,差异具有统计学意义。PK-PD模型拟合采用Winnonlin4.0.1软件进行。实验结果1麻黄-桂枝药对配伍对麻黄碱体外溶出的影响本部分成功建立了HPLC测定水提液中麻黄碱含量的方法：色谱柱为苯基柱(Agilent Eclipse XDB—Phenyle,250mmX4.6mm);流动相为0.02mo1*L1磷酸二氢钾溶液—乙腈(96：4)；流速0.6ml min-1;柱温25℃；检测波长210nm。该方法精密度高,重现性和稳定性良好；提取回收率符合样品的检测要求；分离度高,无其它成分的干扰。随着桂枝配伍比例的增加,麻黄中麻黄碱的体外溶出显著减少。其中,麻黄-桂枝3：2组和3：4组与麻黄单煎液比差异有统计学意义(P<0.05),说明药对配伍可以影响麻黄毒性成分的溶出。2麻黄-桂枝药对配伍对SD大鼠行为学的影响麻黄对SD大鼠具有显著的中枢兴奋作用；桂枝具有显著的镇静作用；麻黄-桂枝药对配伍后,随着桂枝给药剂量的增加,大鼠的兴奋性行为显著减少。给药1h后,麻黄低剂量组和中剂量大鼠与生理盐水组大鼠相比,自主活动增加,站立次数和嗅探次数减少；麻黄高剂量组大鼠给药后,大鼠自主行为和探索行为都显著减少,主要集中在旷场的角落活动,说明高剂量的麻黄已经影响了大鼠的正常生理功能。桂枝低剂量组和中剂量组大鼠无显著的行为学变化,桂枝高剂量组大鼠出现了显著的镇静行为,主要表现为给药时间在1-4h时机警性和自主活动减少,站立次数和嗅探次数增加。麻黄-桂枝3：1配伍组给药1-4h时,与生理盐水组相比兴奋性行为显著,与麻黄碱组大鼠相比行为学无显著差异；麻黄-桂枝3：2和3：4配伍组在给药1-4h时,与麻黄碱组大鼠相比兴奋性作用减弱。戊巴比妥钠睡眠试验结果表明,麻黄碱可以延长戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期,缩短睡眠持续时间。麻黄的药理作用与麻黄碱相似,且与麻黄碱含量成正相关。与生理盐水组相比,麻黄高、中、低剂量组大鼠睡眠潜伏期显著延长,差异具有统计学意义(P值均为0.000)；大鼠的睡眠持续时间显著缩短(P值分别为0.000,0.000,0.049)。与麻黄碱组相比,麻黄低、高、中剂量组大鼠睡眠潜伏期差异均无统计学意义(P值分别为0.288,0.691,0.103)；麻黄高、中剂量组大鼠睡眠持续时间差异均无统计学意义(P值分别为0.625,0.195),麻黄低剂量组差异具有统计学意义(P=0.000)。桂枝可以协同戊巴比妥钠诱导的睡眠实验,缩短大鼠的睡眠潜伏期,增加睡眠时间。但是,与生理盐水组相比,桂枝低、中剂量组无明显变化；桂枝高剂量组睡眠潜伏期无显著性差异(P=0.170),睡眠持续时间有显著性差异(P=0.000)。麻黄-桂枝药对配伍后,与麻黄碱组相比,随着桂枝比例的增加大鼠睡眠潜伏期显著缩短,睡眠持续时间显著延长。其中,药对3：1组睡眠潜伏期平均缩短了78.67s,睡眠持续时间延长了15.17min,差异具统计学意义(P值分别为0.005,0.006)；药对3：2组睡眠潜伏期平均缩短了88.34s,睡眠持续时间延长了26.00min,差异具统计学意义(P值分别为0.004,0.000)；药对3：4组睡眠潜伏期平均缩短了95.17s,睡眠持续时间延长了34.83min,差异具统计学意义(P值分别为0.002,0.000)。麻黄碱可以减少大鼠进入高架桥开臂的次数和停留时间,增加大鼠的焦虑情绪,但组间无显著性差异(F=1.833,P=0.154；F=1.679,P=0.186)。麻黄可以减少大鼠进入高架桥开臂的次数和停留时间,与麻黄碱作用一致,且与给药剂量成正相关。与生理盐水组和麻黄碱组相比,桂枝高、中、低剂量组大鼠进入开臂的次数和停留时间显著增加,且与桂枝给药量成正相关。桂枝低剂量组与生理盐水组相比,开臂进入次数平均增加1.00次,开臂停留时间增加6.23s,差异均具有统计学意义(P值分别为0.044,0.006)；桂枝中剂量组大鼠开臂进入次数平均增加2.50次,开臂停留时间增加9.00s,差异均具有统计学意义(P值均为0.000)；桂枝高剂量组大鼠开臂进入次数平均增加4.67次,开臂停留时间增加15.67s,差异均具有统计学意义(P值均为0.000)。麻黄-桂枝药对配伍后,相比麻黄碱组,药对配伍组大鼠进入高架桥开臂的次数和停留时间显著增加,说明桂枝缓解了麻黄碱引起的焦虑情绪。但是,药对配伍组与生理盐水组和麻黄碱组大鼠相比,进入高架桥开臂的次数均无显著性差异(P值分别为0.087,0.660,0.193；1.000,0.193,0.005)。不同组别大鼠进入开臂的停留时间,组间无显著性差异(F=1.836,P=0.153)。旷场实验中,麻黄碱组大鼠自主活动显著增加,探索性行为显著减少,进入中央区域的次数和站立次数显著减少,差异具有统计学意义(P值均为0.000)；与生理盐水组相比,麻黄低剂量组大鼠的自主活动增加,探索性行为减少；麻黄中剂量组大鼠的自主活动显著增加(P=0.000),探索性行为减少,外围停留时间显著增加(P=0.014)。与麻黄碱组相比,麻黄低剂量组大鼠的运动距离和外围停留时间较少(P值均为0.000),而麻黄中剂量组大鼠的运动距离和外围停留时间差异均无统计学意义(P值分别为0.716,0.155)。桂枝低剂量组大鼠自主活动显著减少(P=0.020),站立次数和跨格数增加,但是差异无统计学意义(P值分别为0.257,0.064)；桂枝中剂量组大鼠自主活动显著减少,平均运动距离减少4.84m(P=0.001),跨格数增加(P=0.034)；桂枝高剂量组大鼠自主活动显著减少(P=0.000),站立次数平均增加6.50次,跨格数增加7.50次,中央区域停留时间显著增加(P值分别为0.041,0.000,0.000)。与生理盐水组相比,药对3：1组大鼠运动距离平均增加6.03m,站立次数减少9.53次,外围停留时间增加,差异均具有统计学意义(P值分别为0.000,0.000,0.006)；药对3：2组大鼠运动距离平均增加2.95m,站立次数减少6.17次,差异均具有统计学意义(P值分别为0.042,0.014)；而药对3：4组大鼠的自主活动和探索性行为均无显著变化。与麻黄碱组相比,药对3：1组大鼠的自主活动显著减少,平均运动距离减少3.82m,差异具统计学意义(P=0.010)。探索活动显著增加,站立次数增加4.50次,差异无统计学意义(P=0.065)；药对3：2组大鼠平均运动距离减少6.90m,站立次数增加8.00次,外围停留时间显著减少,差异具统计学意义(P值分别为0.000,0.002)；药对3：4组大鼠平均运动距离减11.39m,站立次数增加11.33次,外围停留时间显著减少,差异具统计学意义(P值均为0.000)。3麻黄-桂枝药对配伍对大鼠额叶皮层的组织结构及氧化应激相关指标的影响HE染色结果表明,生理盐水组大鼠正常的神经细胞,胞浆丰富,胞核清晰。麻黄碱组大鼠的神经细胞核深染,固缩成三角形或不规则形,核仁不显著或消失,染色质边集而使细胞核呈半月形(或新月形),为细胞凋亡的早期形态学改变。桂枝高、中、低剂量组大鼠的神经细胞与生理盐水组相比无显著差异。麻黄低剂量组大鼠出现细胞核深染的现象,而中、高剂量组大鼠出现了显著的核仁收缩现象。麻黄-桂枝3：1配伍组大鼠局部出现细胞核收缩现象,3：2配伍组部分细胞有核仁深染现象,3：4配伍组无显著的细胞凋亡特征。麻黄碱组大鼠额叶皮层组织的MDA和NO含量显著增加,SOD、CAT和GSH-Px活力显著下降(P值均为0.000)。麻黄高、中、低剂量组大鼠额叶皮层组织的MDA和含量显著增加,NO含量显著增加,SOD、CAT和GSH-Px活力显著降低。桂枝对大鼠额叶皮层无明显的毒副作用,MDA和NO含量以及SOD、CAT和GSH-Px活力均无明显变化。与麻黄碱组相比,药对3：1配伍组大鼠的MAD含量,以及SOD、CAT和GSH-Px活力无显著差异(P值分别为0.535,0.929,0.198,0.175),NO含量增加显著(P=0.006)；药对3：2配伍组大鼠的MDA和NO含量显著减少,SOD、CAT增加显著(P值分别为0.005,0.000,0.014,0.028),GSH-Px活力无显著变化(P=0.078)；药对3：4配伍组大鼠的MDA和NO含量显著减少,SOD、CAT和GSH-Px活力显著增加,差异具统计学意义(P值均为0.000)。4麻黄-桂枝药对配伍对大鼠额叶皮层组织中麻黄碱蓄积及氨基酸类神经递质释放的影响本部分成功建立了UPLC-ESI-MS/MS测定大鼠额叶皮层组织样品中麻黄碱和谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、天冬氨酸(Asp)及甘氨酸(Gly)等氨基酸类神经递质含量的方法,并进行了方法学确证。麻黄-桂枝药对配伍后影响了麻黄碱在大鼠额叶皮层的吸收分布,随着桂枝配伍比例的升高,麻黄碱在额叶皮层的分布和代谢显著加快,减少了麻黄碱的蓄积。同时,通过测定不同给药天数麻黄碱在大鼠额叶皮层的含量,证明单煎液和配伍组麻黄碱的代谢过程不随给药天数的不同发生变化。麻黄碱可以引起大鼠额叶皮层发生兴奋性变化,迅速升高兴奋性氨基酸含量,并且代偿性出现抑制性氨基酸含量升高,最终导致氨基酸类神经递质比例失调。其中,Glu和GABA含量变化相对Gly和Asp变化更加敏感。麻黄-桂枝药对配伍后,桂枝可以抑制麻黄碱诱导的兴奋性毒性。5 PK-PD联合模型法研究麻黄-桂枝药对配伍对大鼠中枢神经系统的作用本部分成功建立了UPLC-ESI-MS/MS测定大鼠血液透析液和脑透析液样品中麻黄碱含量及脑透析液中谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)等氨基酸类神经递质含量的方法,并进行了方法学确证。不同组别间血液药动学参数AUC、Tmax和Cmax无显著性差异；配伍组与麻黄碱组和麻黄组相比,T1/2和MRT显著缩短,Vz/F显著降低,CLz/F显著增加。不同组别间脑透析液中麻黄碱的药动学参数AUC和Cmax无显著性差异；配伍组与麻黄碱组和麻黄组相比,Tmax、T1/2和MRT显著缩短,VZ/F显著降低；与麻黄碱组相比,配伍组CLz/F显著增加。通过PK-PD模型拟合,麻黄碱药效指标的最佳药效动力学模型为Sigmoid-Emax模型。以麻黄碱在大鼠脑脊液中的浓度变化为药动学观察指标(PK),以氨基酸类神经递质含量的动态变化为药效学指标(PD),各组Glu的E-C曲线均呈顺时针环,各组GABA的E-C曲线均呈逆时针环。结论1通过考察药对配伍对麻黄碱体外溶出的影响,表明麻黄-桂枝药对配伍后麻黄碱的体外溶出显著降低,呈现规律性变化,可能是药对配伍减毒的作用机制之一。2通过旷场实验、高架十字迷宫实验和戊巴比妥钠睡眠试验等实验,表明桂枝和麻黄均可影响大鼠中枢神经系统功能,在一定剂量范围内与给药量成正相关。麻黄可以兴奋大鼠的中枢神经系统,出现自主活动增加、焦躁不安的兴奋性毒副作用。桂枝具有镇静和抗焦虑作用,可以增加大鼠的探索性活动。麻黄-桂枝药对配伍后,桂枝可以拮抗麻黄的兴奋性毒副作用,使大鼠的中枢神经系统功能趋于正常。麻黄碱是麻黄产生兴奋性毒性的主要成分。3通过病理切片制作和氧化应激指标测定,表明连续口服麻黄碱可以造成大鼠额叶皮层部位的组织损伤,出现神经细胞凋亡、氧化应激产物增加、抗氧化酶活力降低的毒性反应。桂枝对大鼠额叶皮层无显著的毒副作用。麻黄-桂枝药对配伍以后,麻黄碱诱导的毒性反应显著得到抑制。4通过测定组织中麻黄碱和氨基酸类神经递质的含量变化,表明麻黄碱可以引起兴奋性氨基酸类神经递质升高,多次灌胃给予大鼠麻黄碱可以产生耐受性；麻黄-桂枝药对配伍后,兴奋性氨基酸含量降低,抑制性氨基酸含量升高,说明桂枝可以抑制麻黄碱诱导的兴奋性毒性。5通过PK-PD模型拟合,麻黄碱药效指标的最佳药效动力学模型为Sigmoid-Emax模型。E-C曲线表明不同配伍组大鼠对麻黄碱均产生了显著的耐受性,桂枝可以抑制麻黄碱引起的兴奋性变化。