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目的:骨组织工程技术是骨缺损结构及功能性修复的关键,为重建骨缺损部位的功能结构,实现骨组织工程支架结构和力学环境与正常骨组织的仿生,本课题组以丝素蛋白、胶原蛋白和纳米羟基磷灰石作为原料,采用低温三维打印技术和真空冷冻干燥技术制备仿生复合骨组织工程支架,并以小鼠成骨细胞系MC3T3-E1作为种子细胞定向构建功能性骨单元,从而为骨缺损的治疗提供一定的理论依据。方法:1.骨组织工程支架原料的提取:家蚕丝经过碱液煮沸、脱胶、透析及浓缩后提取得到丝素蛋白。新鲜牛肌腱经含胃蛋白酶的醋酸溶液处理后通过盐析法制得胶原蛋白。2.仿生复合骨组织工程支架的制备:将质量比为3:9:2的丝素蛋白、胶原蛋白和纳米羟基磷灰石充分搅拌混匀置入24孔板中,-80℃过夜后使用真空冷冻干燥机制备复合材料支架(编号A组)。同时取相同质量比的丝素蛋白、胶原蛋白和纳米羟基磷灰石充分搅拌混匀装入低温打印机料筒,设置三维打印控制参数,使用低温三维打印机和真空冷冻干燥机制备复合材料支架(编号B组)。两组支架经过无水乙醇、Na OH溶液及Co60灭菌处理后备用。3.仿生骨支架理化性能的检测:采用微计算机断层扫描技术对A组和B组支架结构进行分析,力学试验机检测仿生支架的力学性能。采用X射线多晶衍射仪、付立叶变换红外光谱仪以及示差扫描量热仪分析支架材料的分子结构。4.组织工程化培养模型的建立:取相同密度的MC3T3-E1细胞接种于两组支架,在37℃、5%CO2条件下培养4 h后,加入α-MEM完全培养液,A组为对照组,B组为实验组,每2天换1次等量的培养液。5.仿生骨支架材料的细胞相容性分析:采用MTT和碱性磷酸酶(ALP)法分别检测两组支架细胞增殖和分化情况,倒置显微镜及扫描电镜(SEM)观察每组支架表面和内部细胞生长情况,采用实时定量荧光多聚集链反应(Real-time PCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞特异性基因表达情况。结果:1.两组支架形态稳定,B组比A组支架更为规整,较符合设计的支架模型。2.两组复合支架材料均为三维多孔结构,具有一定的孔径、孔隙率及吸水膨胀率:A组支架孔径为(163.15±61.93)μm,壁厚为(290.42±71.19)μm,孔隙率为(92.21±2.16)%,吸水膨胀率为(724.09±98.05)%;B组支架大孔径为(506.37±18.63)μm,小孔径为(62.14±17.35)μm并存,两者并存,壁厚为(91.63±18.11)μm,孔隙率为(97.70±1.37)%,吸水膨胀率为(1341.97±64.41)%。A、B组的弹性模量分别为(31.91±11.25)k Pa和(340.93±71.98)k Pa,A组低于B组(P<0.05)。X衍射图谱、红外光谱以及示差扫描量热图显示A组与B组支架原料的特征性峰值相似,表明蛋白分子结构、分子结晶度以及分子间作用力并无明显改变。3.MTT法和ALP活性检测结果表明,实验组细胞的增殖和分化活性高于对照组。倒置显微镜及扫描电镜下可见两组支架表面有大量细胞粘附生长,充分伸展,而且实验组大孔壁上细胞粘附生长良好,培养至21天细胞可布满部分孔隙。支架与细胞共培养21天后,Real-time PCR结果表明实验组MC3T3-E1细胞COLⅠ、ALP及OCN基因的转录水平高于对照组(P<0.05),Western blot结果表明对照组及实验组COLⅠ、ALP及OCN蛋白翻译水平均良好。结论:1.两组支架形态规则,均为三维多孔结构。低温三维打印制备工艺参数的“个性化”,使得骨组织工程支架具有可控性的大、小孔径,可提供更多的细胞粘附面积。B组支架在孔径大小、孔隙率、吸水膨胀性及力学性能等方面优于A组,有利于细胞养料和代谢产物的运输。2.低温三维打印技术及真空冷冻干燥制备工艺均未破坏复合骨支架原材料的分子结构与蛋白活性,支架有机成分与无机成分的生物活性仍保持不变。3.MC3T3-E1细胞系接种两组支架后均能正常生长增殖,实验组细胞生长、增殖及分化情况优于对照组,表明支架的微结构影响其力学性能及生物学行为,采用低温三维打印工艺联合冷冻干燥技术制备的支架更能接近修复骨缺损的目标。