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少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）是一种捕食线虫的模式真菌，当它的生活方式由腐生阶段转变为寄生阶段时，通过形成3D捕食环来捕获线虫，线虫成为其寄生生活的主要营养来源。当前A.oligospora捕食线虫的分子机制逐渐成为研究的热点。
在实验室前期研究中，发现氨肽酶是A.oligospora在贫瘠营养条件下分泌至培养液中的一种主要蛋白质组分，由此推测氨肽酶可能会参与到少孢节丛孢菌生活方式的转变过程中，并可能与少孢节丛孢菌捕食线虫活性有关。因此，本文对少孢节丛孢菌氨肽酶基因AOL_s00110g315（以下简称g315）进行研究。一方面，在大肠杆菌系统对g315进行异源表达，并将重组氨肽酶作用于秀丽隐杆线虫，探究其直接杀虫效应；另一方面，利用同源重组构建基因敲除菌株，比较敲除菌株与野生型菌株在生长形态、产孢子量及捕食线虫能力上的区别。除此之外，为了进一步探讨其功能，对基因g315进行原位荧光标记，研究其亚细胞定位。根据以上实验设计，本文获得的部分研究结果如下：
（1）基因g315的生物信息学分析：g315编码的蛋白含有两个保守结构域，PA超家族和锌肽酶超家族，与来源于酿酒酵母和链霉菌的APY和SGAP类似。通过氨基酸序列预测在1-18位点的氨基酸编码信号肽序列，蛋白分子量为51.2KDa，理论等电点5.55，不稳定指数为36.93。多序列比对和同源建模结果表明氨肽酶g315与灰链霉菌氨肽酶APX_STRGG（accession No.P80561）、人源谷氨酰胺基肽环转移酶QPCTL（accession No.Q9NXS2）、厌氧杆菌氨肽酶Amp（accession No.A2V759）具有较高的同源性。
（2）氨肽酶g315的异源表达和复性：去除其信号肽获得目的基因，将其克隆至带有His标签的pet28a表达载体中，并成功在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了原核表达。SDS-PAGE检测发现其重组蛋白主要以包涵体的形式存在。使用尿素对其进行变性处理，采用透析处理的方式去除变性剂，并对其进行复性。对包涵体进行复性后的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示重组氨肽酶分子量约为51.2kDa。
（3）氨肽酶杀线虫活性的研究：同期化处理秀丽隐杆线虫至L4期，加入不同浓度重组氨肽酶，并设置对照组。在处理后12、24和36h观察线虫的活力，并对死亡的线虫进行计数。实验结果表明重组氨肽酶对于线虫具有杀伤作用。
（4）原位标记菌株和敲除菌株的构建：基于同源重组原理，利用PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法和潮霉素抗性平板筛选，获得相应转化子，并采用PCR及测序鉴定。目前已成功筛选到原位标记菌株，而敲除菌株由于其同源重组效率较低，没有得到阳性的敲除菌株。
为了进一步完善实验结果，后续实验还要继续筛选敲除菌株，并对敲除菌株的生长表型和捕食线虫的能力进行评估；此外，对于原位荧光标记菌株，还要测定其荧光，探讨氨肽酶的亚细胞定位。氨肽酶是一种重要的水解酶，可能参与到真菌生活方式转变过程中蛋白质的水解和成熟。本文基于对A.oligospora氨肽酶基因（AOL_s00110g315）的生物学功能的初步探究，为进一步研究真菌与线虫作用的分子机制提供了依据。
在实验室前期研究中，发现氨肽酶是A.oligospora在贫瘠营养条件下分泌至培养液中的一种主要蛋白质组分，由此推测氨肽酶可能会参与到少孢节丛孢菌生活方式的转变过程中，并可能与少孢节丛孢菌捕食线虫活性有关。因此，本文对少孢节丛孢菌氨肽酶基因AOL_s00110g315（以下简称g315）进行研究。一方面，在大肠杆菌系统对g315进行异源表达，并将重组氨肽酶作用于秀丽隐杆线虫，探究其直接杀虫效应；另一方面，利用同源重组构建基因敲除菌株，比较敲除菌株与野生型菌株在生长形态、产孢子量及捕食线虫能力上的区别。除此之外，为了进一步探讨其功能，对基因g315进行原位荧光标记，研究其亚细胞定位。根据以上实验设计，本文获得的部分研究结果如下：
（1）基因g315的生物信息学分析：g315编码的蛋白含有两个保守结构域，PA超家族和锌肽酶超家族，与来源于酿酒酵母和链霉菌的APY和SGAP类似。通过氨基酸序列预测在1-18位点的氨基酸编码信号肽序列，蛋白分子量为51.2KDa，理论等电点5.55，不稳定指数为36.93。多序列比对和同源建模结果表明氨肽酶g315与灰链霉菌氨肽酶APX_STRGG（accession No.P80561）、人源谷氨酰胺基肽环转移酶QPCTL（accession No.Q9NXS2）、厌氧杆菌氨肽酶Amp（accession No.A2V759）具有较高的同源性。
（2）氨肽酶g315的异源表达和复性：去除其信号肽获得目的基因，将其克隆至带有His标签的pet28a表达载体中，并成功在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了原核表达。SDS-PAGE检测发现其重组蛋白主要以包涵体的形式存在。使用尿素对其进行变性处理，采用透析处理的方式去除变性剂，并对其进行复性。对包涵体进行复性后的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示重组氨肽酶分子量约为51.2kDa。
（3）氨肽酶杀线虫活性的研究：同期化处理秀丽隐杆线虫至L4期，加入不同浓度重组氨肽酶，并设置对照组。在处理后12、24和36h观察线虫的活力，并对死亡的线虫进行计数。实验结果表明重组氨肽酶对于线虫具有杀伤作用。
（4）原位标记菌株和敲除菌株的构建：基于同源重组原理，利用PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法和潮霉素抗性平板筛选，获得相应转化子，并采用PCR及测序鉴定。目前已成功筛选到原位标记菌株，而敲除菌株由于其同源重组效率较低，没有得到阳性的敲除菌株。
为了进一步完善实验结果，后续实验还要继续筛选敲除菌株，并对敲除菌株的生长表型和捕食线虫的能力进行评估；此外，对于原位荧光标记菌株，还要测定其荧光，探讨氨肽酶的亚细胞定位。氨肽酶是一种重要的水解酶，可能参与到真菌生活方式转变过程中蛋白质的水解和成熟。本文基于对A.oligospora氨肽酶基因（AOL_s00110g315）的生物学功能的初步探究，为进一步研究真菌与线虫作用的分子机制提供了依据。