目的:研究丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(mammalian Ste20-like kinase 4,MST4)在角膜上皮细胞抗烟曲霉菌免疫反应中的作用和分子机制。方法:1、烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠角膜,建立小鼠真菌性角膜炎动物模型,观察感染不同时间点后小鼠角膜的临床评分,采用Western blot法检测正常小鼠角膜和感染12小时、1天、3天、5天的小鼠角膜中MST4蛋白的表达。烟曲霉菌菌丝刺激永生化人角膜上皮细胞,应用Western blot法检测正常和烟曲霉菌刺激12小时、24小时的人角膜上皮细胞中MST4蛋白的表达。采用免疫荧光染色检测正常小鼠角膜和感染3天的小鼠角膜中MST4表达及定位。2、给予不同浓度外源性的MST4重组蛋白(2、5、10ng/ml)预处理人角膜上皮细胞2小时后,烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞12小时和24小时,采用PCR法和ELISA法检测各组人角膜上皮细胞中IL-1β、IL-6和IL-8 m RNA和蛋白的表达。3、给予Dectin-1配体凝胶多糖(Curdlan)或Dectin-1抑制剂昆布多糖(Laminarin)预处理人角膜上皮细胞10小时后,烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞24小时,Western blot法检测各组人角膜上皮细胞中MST4蛋白的表达。4、给予不同浓度外源性的MST4重组蛋白(2、5、10ng/ml)预处理人角膜上皮细胞2小时,再加入Curdlan刺激人角膜上皮细胞10小时和24小时,采用PCR法和ELISA法检测各组人角膜上皮细胞中IL-1β、IL-6、IL-8的m RNA和蛋白表达。给予外源性的MST4重组蛋白(2、5ng/m L)预处理RAW264.7小鼠巨噬细胞2小时,再加入Curdlan刺激RAW 264.7细胞8小时,采用PCR法检测各组RAW264.7细胞中IL-1β和IL-6 m RNA的表达。5、分别使用不同浓度的外源性MST4重组蛋白(2、5、10、50ng/m L)处理人角膜上皮细胞24小时、48小时和72小时,应用CCK8试剂盒和细胞计数实验检测人角膜上皮细胞的增殖能力。结果:1、烟曲霉菌感染1天、3天、5天的小鼠角膜中MST4的蛋白表达明显高于正常角膜,其中感染后3天MST4的蛋白表达最高;烟曲霉菌刺激12小时、24小时的人角膜上皮细胞中MST4的蛋白表达高于正常对照组;烟曲霉菌感染3天的小鼠角膜中MST4的荧光染色较正常角膜增强。2、烟曲霉菌明显促进了人角膜上皮细胞中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8)的m RNA和蛋白表达。MST4重组蛋白(2、5、10ng/ml)预处理组细胞中上述细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8)的m RNA和蛋白表达水平较单纯加菌组降低。3、烟曲霉菌刺激组人角膜上皮细胞中MST4的蛋白水平较正常对照组升高,Curdlan预处理组人角膜上皮细胞中MST4的蛋白水平较单纯加菌组升高,而Laminarin预处理组人角膜上皮细胞中MST4的蛋白水平较单纯加菌组降低。4、Curdlan促进了人角膜上皮细胞中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8)的m RNA和蛋白表达,MST4重组蛋白(2、5、10ng/ml)预处理组细胞中上述细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8)的m RNA和蛋白水平较单纯Curdlan处理组降低。此外,Curdlan明显促进了RAW264.7细胞中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6)的m RNA表达,MST4重组蛋白(2、5ng/ml)预处理组RAW264.7细胞中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6)的m RNA水平较单纯Curdlan处理组降低。5、烟曲霉菌或Curdlan能诱导角膜上皮细胞中Syk的磷酸化,MST4降低了烟曲霉菌或Curdlan诱导的角膜上皮细胞中Syk磷酸化水平。6、不同浓度MST4重组蛋白(2、5、10、50ng/ml)处理24小时后人角膜上皮细胞的增殖与对照组比无明显差异,MST4重组蛋白处理48和72小时均可促进人角膜上皮细胞的增殖。MST4处理48小时后对人角膜上皮细胞增殖的促进作用与MST4成剂量相关性。结论:烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠角膜和人角膜上皮细胞可以引起MST4的表达升高,模式识别受体Dectin-1可以调控角膜上皮细胞中MST4的表达。MST4通过抑制角膜上皮细胞中Syk的磷酸化抑制烟曲霉菌或Dectin-1介导的炎症反应。MST4促进人角膜上皮细胞增殖。