人细胞色素P450 3A4 (CYP3A4)参与50%以上临床常用药物的代谢和诸多典型致癌物的活化。其活性可以被许多物质所诱导或抑制,这使得临床上在药物合用时会产生毒副作用增加、药效降低甚至无效的结果。了解CYP3A4的调控将有助于指导临床合理用药,为减轻或避免药物的毒副作用提供科学依据。本文采用建立阿霉素体外逐步诱导的方式建立了多药耐药细胞K562细胞模型,蛋白质组学技术手段寻找与耐药相关蛋白,研究其在肿瘤多药耐药中的贡献,及与CYP3A4之间的关联,为理论及临床应用提供依据。1.K562耐药细胞的建立及双向电泳法寻找分子靶点采用建立阿霉素体外逐步诱导的方式建立了多药耐药细胞K562细胞模型,K562细胞与阿霉素ADR共存的初期,细胞总处于增殖死亡的动态过程中,直至半年后,药物一直维持在1 mg/L浓度下,细胞的耐药特性趋于稳定。细胞的形态转好,增殖周期加快,与母细胞无异。诱导的K562/ADR细胞与母细胞相比,不但表现出对ADR高度耐受,而且有多药耐药现象,尤其是长春新碱(VCR)和伊马替尼(imatinib), K562/ADR对ADR、VCR、imatinib的IC50分别提高了149、134和63.3倍,提示所建的耐药细胞获得了多药耐药特性。应用高效液相色谱法测定耐药株细胞内阿霉素的积聚情况,结果显示,在2 hr时,K562细胞内的阿霉素含量约为2.925μmol/L·mg,比K562/ADR细胞内阿霉素的含量1.522μmol/L·mg高,p<0.001,提示K562/ADR的P-gp外排泵可能发挥作用,将阿霉素排出细胞。1week后,K562细胞几乎全部死亡,而K562/ADR细胞内的阿霉素积聚显著升高但不影响其生理活性,提示K562/ADR细胞内除了P-gp药物外排泵还有其他耐药机制在发挥着作用。此外,由于阿霉素主要通过CYP3A4代谢酶进行代谢,故检测了K562与K562/ADR细胞内CYP3A4的表达变化,结果显示CYP3A4表达变化不是引起K562细胞多药耐药产生的原因。为全面了解K562多药耐药产生的分子机制,利用蛋白质组学技术,用固相pH梯度等电聚焦双向凝胶电泳,对所建立的以转运蛋白高表达为主要耐药机理的K562/ADR细胞进行了研究,探讨细胞耐药后蛋白的变化,对只表达变化差异大的部分蛋白点进行MALDI-TOF/TOF分析,搜索Swiss-Prot蛋白库,鉴定了几个蛋白的身份,这些蛋白质表达情况的变化,是人白血病细胞K562从对药物敏感到接触到化疗药物ADR后转运蛋白高表达,以至产生多药耐药特性这一变化中细胞内一系列分子事件的直接体现,是转运蛋白及其表达调控的分子基础。这些蛋白根据功能的不同总体可分为钙结合蛋白、分子伴侣(chaperones)、代谢酶相关蛋白、蛋白合成或DNA合成相关蛋白等等。2.ANXA1蛋白的调节对K562细胞耐药行为的影响为证实双向电泳结果的可靠及真实,进一步利用Western blot与细胞免疫化学方法验证Spot1蛋白(ANXA1蛋白)在K562、K562/ADR细胞中的表达差异。应用pcDNA3.1(+)系统成功构建ANXA1的表达载体,并稳定转染得到经western blot鉴定的能稳定表达ANXA1的K562/ADR细胞系。之后以该细胞系完成了对ADR及VCR的细胞毒性的影响的研究。实验结果显示,表达上调的K562/ADR细胞对ADR及VCR的耐受程度显著下降。同时,应用人工合成miRNA技术手段,构建ANXA1发夹结构表达载体,并稳定转染得到经western blot鉴定的下调ANXA1表达的K562细胞系,对其ADR和VCR的IC50进行考察,结果显示,ANXA1表达下调的K562细胞对ADR的耐受程度显著提高,而对VCR的耐受程度几乎和表达空载体的空白细胞一致。同时检测稳定转染ANXA1的K562/ADR的DNAladder情况,结果显示ANXA1表达上调的转染细胞的细胞凋亡情况比对照细胞有所增加,提示ANXA1通过介导K562细胞凋亡发挥作用。3.乳腺癌MCF-7细胞中ANXA1和CYP3A4表达调控研究本部分实验分析乳腺癌细胞MCF-7敏感细胞与耐药细胞ANXA1的表达情况,与K562中ANXA1的表达情况相反,提示ANXA1在实体肿瘤细胞和血液系统肿瘤细胞中发挥的作用不同。检测MCF-7细胞中ANXA1、IL-6和CYP3A4 mRNA水平和蛋白水平,结果提示在MCF-7细胞中ANXA、IL-6及CYP3A4可能存在信号通路调控通路。结合国内外文献检索报道结果,推测实体肿瘤MCF-7细胞中,ANXA1表达通过IL-6调控下游CYP3A4行为,影响药物代谢情况,这也可能是肿瘤产生多药耐药的原因之一。这些结果为将来进一步利用本实验中建立的细胞体系对ANXA1和CYP3A4在肿瘤细胞多药耐药中的作用及表达调控研究、指导临床用药及初期诊断提供依据。4.胃癌ANXA1核定位与腹腔转移的研究肿瘤多药耐药现象是临床肿瘤恶性行为之一。除了多药耐药现象外,肿瘤的分化、浸润深度、淋巴结转移等也是肿瘤进程的重要指标。本文考察了浙江大学附属邵逸夫医院肿瘤科收集的104对胃癌病人组织样本中ANXA1的表达与定位。免疫组化结果显示,ANXA1在胃癌组织与正常组织中均表达。ANXA1同时存在胞浆定位和核定位。分析ANXA1胞浆定位和核定位与临床病理参数的关系后显示，ANXA1不仅与多药耐药的肿瘤临床恶性行为有关,ANXA1的核定位与肿瘤大小、腹腔转移和TNM分期高度相关。ANXA1可作为胃癌独立预后指标指导临床诊断与治疗。