为了探究脂筏的形成与多药耐药之间的关系,以及解决耐药细胞膜的脂筏中高密度的脂质堆积引起膜内吞功能受损的问题,本文构建了一种能消耗脂筏中胆固醇的双载药纳米药物递送系统,并对其响应特性、脂筏与耐药的相关性和抗肿瘤活性等进行了系统性的研究。研究内容如下:(1)纳米系统的构建与表征 首先,通过维生素E琥珀酸酯(α-VES)和聚乙二醇2000双胺(PEG2k-diamine)的酰胺反应合成α-生育酚氨基聚乙二醇2000琥珀酸酯(TPGS2k-NH2)。然后,通过傅里叶变换红外光谱和核磁共振氢谱鉴定TPGS2k的合成。最后,将盐酸多柔比星(DOX·HCl)脱盐酸成DOX后,再将辛伐他汀(SV)、DOX和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的溶液混合并作为油相缓慢地滴入TPGS2k的水溶液中,合成包封DOX和SV的双载药纳米粒(SV/DOX@TPGS2k-PLGA NPs)。利用紫外光谱和高效液相色谱建立了 DOX和SV的体外分析方法;采用激光纳米粒度仪(DLS)和透射电镜(TEM)考察了纳米系统的粒径电位及形态特征。DLS结果表明SV/DOX@TPGS2k-PLGA NPs的粒径约150 nm,电位约-23.1 mV,均一稳定。TEM结果显示纳米粒呈球形,没有出现明显的团聚现象,适合用作纳米递送系统。(2)体外释药特性研究 通过紫外分光光度计和高效液相色谱仪考察了在不同pH条件下,DOX和SV的体外酸响应释放特性。结果表明,DOX和SV在体外模拟肿瘤内酸性环境中的累计释放率分别为80%和85%,与正常生理条件相比明显增高。同时,7天后药物的累计释放率仍在增加,表明药物仍有持续释放的可能,这可能由于PLGA的缓释特性以及TPGS2k作为合成载体的表面活性剂增加了载体的稳定性。(3)体外抗肿瘤活性、细胞摄取及脂筏与耐药相关性研究 通过MTT法考察空白载体的生物相容性以及该纳米递送系统对SW620/AD300细胞的抑制效果。采用荧光显微镜及流式细胞仪考察细胞摄取情况以及SW620/AD300细胞的耐药程度。采用胆固醇试剂盒和免疫荧光实验考察SV/DOX@TPGS2k-PLGANPs是否通过降低脂筏中胆固醇的含量阻断脂筏的形成。通过JC-1线粒体试剂盒和Western实验考察了该纳米控释系统对耐药有关蛋白的表达水平和对线粒体膜电位的影响。体外细胞实验表明,空白载体没有明显的毒副作用,SV/DOX@TPGS2k-PLGA NPs可以明显抑制细胞的增殖。与游离DOX相比,SW620/AD300细胞对SV/DOX@TPGS2k-PLGANPs的摄取率显著提高,这有利于逆转细胞的耐药性。同时,我们证明了 SW620/AD300细胞中脂筏的存在以及脂筏中胆固醇的降低可以阻断脂筏的合成,且进一步研究了该纳米递送系统破坏脂筏后,逆转耐药性的具体机制。(4)体内靶向性及抗肿瘤活性研究以荷SW620/AD300结肠癌细胞的BALB/c裸鼠为动物模型,将IR783作为荧光探针,采用活体荧光成像系统分别考察了游离IR783和IR783@TPGS2k-PLGA NPs在裸鼠体内的靶向性和组织分布情况。通过裸鼠体重、肿瘤体积变化、H&E染色及TUNEL染色等考察该递药系统的抗肿瘤效果及安全性。体内活动成像结果表明该递送系统由于EPR效应在肿瘤部位累积,且对其他主要器官无明显的毒副作用。体内药效学结果显示,SV/DOX@TPGS2k-PLGANPs逆转了 SW620/AD300肿瘤的耐药性,且对肿瘤有显著的抑制作用。总而言之,本文构建的SV/DOX@TPGS2k-PLGA纳米控释系统可以降低脂筏中胆固醇的含量,阻断脂筏的形成,增强细胞膜流动性和恢复膜内吞功能。通过降低P-糖蛋白(P-gp)的活性,减少药物的外排以及改变线粒体膜电位促进细胞凋亡,该纳米系统成功逆转了 SW620/AD300细胞的耐药性。