白桦BpCUC2基因的表达特性及遗传转化

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CUC2 (CUP-SHAPED COTYLEDON2)属于植物特有的NAC家族NAM超家族成员。该基因在植物顶端分生组织的形成、器官原基的形成及边界的建立、叶边缘形态建成、花的形态建成及生长发育等过程中发挥作用,并受miR164的调控。以往对该基因的研究主要集中在模式植物拟南芥、水稻中,在木本植物中的研究鲜有报道。本研究以白桦(Betula platyphylla Suk.)为遗传转化受体,进行白桦BpCUC2基因的表达特性分析及该基因的遗传转化研究,为人们进一步了解该基因的功能奠定基础。研究结果如下:(1) BpCUC2基因表达特性研究表明:克隆BpCUC2基因上游1497bp,分析该序列的顺式作用元件,结果表明,该序列含有TATA-box. CAAT-box、激素响应、环境胁迫响应和转录因子结合等不同元件。选取生长素响应元件CATATGGMSAUR的核心序列CATATG,构建报告载体,利用酵母单杂交技术获得20条与该元件互作的蛋白,这些蛋白均具有转录因子特性的蛋白质结构功能域。构建PromCUC2::LUC载体,采用根癌农杆菌介导的合子胚法进行白桦的遗传转化,PCR检测已成功获得3个转基因株系。对转基因株系的顶芽、叶、茎、根等组织部位进行实时定量PCR,结果表明,PromCUC2具有启动LUC表达的活性和时空表达特异性,顶芽中的表达量高于其它组织部位,叶次之,在根中的表达量最低。对获得的转PromCUC2::LUC株系分别进行MeJA、ABA、IAA、GA激素的处理,结果表明,不同组织部位对4种激素的应答反应不一致。(2) BpCUC2基因的遗传转化研究表明:从白桦中克隆得到BpCUC2基因,经过多序列比对分析确定该基因属于NAC家族NAM超家族成员,且与拟南芥AtCUC2、葡萄VvCUC2等基因具有较高相似度,这些基因均与顶端分生组织和叶片的发育相关。根据miR164调控BpCUC2基因序列,采用重叠延伸PCR克隆BpCUC2-m基因,应用酶切技术构建白桦BpCUC2基因的植物过表达、抑制表达载体和抗miR164调控的BpCUC2-m过表达载体。采用根癌农杆菌介导的合子胚法进行白桦的遗传转化,通过PCR、实时荧光定量PCR和Northern杂交对转基因植株进行鉴定,结果表明,BpCUC2已成功整合到植物基因组内并在mRNA水平有表达。通过对转35S::BpCUC2白桦株系进行表型观察,发现其苗高比对照植株的苗高低34.03%、47.53%,节间距主要位于0~1.2cm,而对照植株的节间距主要位于0.8~2.0cm。
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