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植物体在病原菌侵染下如何通过超敏反应(HR)限制病原菌扩增到目前为止还不清楚,最近研究显示自噬起了一个必要作用,研究自噬和超敏反应的机制非常重要。在植物先天性免疫反应中,自噬作为一种保护机制,限制病原菌侵染引起的程序性细胞死亡(PCD)。自噬相关基因5(ATG5)在拟南芥的自噬作用中起非常重要的作用。本文以模式生物拟南芥为材料,结合激光共聚焦显微镜及免疫组化等技术,探究在丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst DC3000)和含有无毒因子的丁香假单胞菌DC3000(Pst-avrB和Pst-avrRps4)侵染导致的超敏性细胞死亡(HR-PCD)过程中ATG5的作用。主要结果如下: (1)丁香假单胞菌(P.syringae)在拟南芥中具有细胞死亡诱导效应并引起防御反应。台盼蓝(Trypan Blue)染色结果显示,三种P.syringae均能诱导细胞发生死亡。RT-PCR结果显示:在野生型中,Pst-avrRps4和Pst-avrB侵染导致防御相关基因PR1、PR2,水杨酸信号的标志基因NPR1,液泡合成酶基因γVPE和疾病易感增强基因EDS1表达量均增加,而且比PstDC3000侵染增加明显,说明这些基因参与了植株对其的防御作用。而ATG5的表达量下降,指出该基因在防御的初期起到关键的作用。 (2)P.syringae影响ATG5的表达及定位。激光共聚焦和免疫印迹结果显示,这三种P.syringae处理后,ATG5的表达增强,并且ATG5参与到自噬的过程中;Pst-avrRps4和Pst-avrB处理能诱导产生自噬小体。免疫组化结果显示,在处理后,ATG5蛋白不仅表达在细胞质,在细胞核中也有表达(有数据库中指出ATG5表达在细胞质)。 (3)ATG5参与的自噬限制HR-PCD和活性氧(ROS)的积累。在atg5-1突变体中,这三种P.syringae侵染后,细胞死亡扩散到许多新长出的健康叶片中,同时ROS的积累更多。 (4)在水杨酸(SA)信号通路阻断的npr1-1突变体中,Pst-avrRps4不能诱导产生自噬小体,说明自噬依赖于SA信号途径。 我们采用自己构建的荧光蛋白标记的转基因植物,首次将这三种P.syringae放在一起,进行对比研究。发现ATG5在这三种P.syringae侵染初期限制其生长,并且与自噬小体共定位。在处理之后,ATG5主要表达在细胞质和细胞核中。因此,ATG5对于限制P.syringae所诱导的超敏反应程序性死亡是必需的,可能是通过SA信号途径引起的自噬作用。