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抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在机体抗感染、抗肿瘤等免疫应答中发挥重要作用。定量分析抗原特异性CD8+CTL可为阐明这些免疫应答的自然发生过程提供重要信息。传统的检测外周血单个核细胞(PBMC)中抗原特异性CTL的方法有51Cr释放杀伤实验和有限稀释法，但均为间接性方法，且操作繁琐，大大低估了总的抗原特异性CTL的数量。近年发展起来的基于流式细胞术的主要组织相容性复合体(MI-IC)一抗原肽四聚体技术，具有很高的敏感性、特异性、高效性，成为T细胞免疫研究中的关键技术之一。
大量证据表明髓系白血病患者接受异基因造血干细胞移植后，强大的移植物抗白血病(GVL)效应是由识别白血病细胞提呈的抗原的T细胞介导的。近年来一系列白血病相关抗原得到鉴定，其中包括蛋白酶3(P3)和WTl抗原。P3是一种髓系限制性的相对分子质量26kD的丝氨酸蛋白酶，在大部分髓系白血病细胞异常表达。PRl(aal69-177)是P3的一个HLA-A*0201限制性的抗原表位。PRl特异性CTL可选择性溶解白血病原始细胞和抑制白血病细胞集落生长。WTl抗原表达水平在急性髓系白血病(AML)和慢性髓系白血病(CML)异常升高。WTl特异性CTL可以选择性清除白血病CD34+原始细胞。
为制备HLA-A*0201-PRl和HLA—A*020i-WTl四聚体，以检测白血病患者体内PRl特异性CTL和WTl特异性CTL，本实验进行了如下工作：
利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从基因型HLA-A*0201的健康人白细胞中扩增了β2微球蛋白(β2m)基因和HLA-A*0201重链分子胞外区基因，并在HLA-A*0201重链分子胞外区的羧基端拼接上由15个氨基酸残基组成的BirA酶依赖的可生物素化序列(BSP)。利用NdeI和BadtI限制性核酸内切酶，将β2m基因连接到pET-17b载体。利用EcoRI和BamHI，将HLA-A*0201-BSP融合基因连接到pBV220载体。重组质粒pET-β2m和pBV220-HLA-A*0201一BSP分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和DH5a，并以包涵体的形式高效表达了目的蛋白，分别占菌体总蛋白的3296和28％。
在分别纯化了β2m和HLA-A*0201-BSP后，在抗原肽PRl存在的条件下，采用稀释复性法构建可溶性的HLA-A*0201-PRl复合物。利用BirA酶对可溶性的HLA-A*0201-PRl复合物进行生物素标记，并采用阴离子交换柱纯化生物素化的HLA-A*0201-PRl复合物。利用凝胶过滤高效液相色谱分析了HLA-A*0201一PRl复合物的生成率，并利用构象特异性的单克隆抗体(BB7．2)对其进行了鉴定。按照4：1的摩尔比，将生物素化的HLA-A,0201-PRl复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素混合后，成功制备了HLA—A*0201-PRl四聚体。采用同样的方法，又成功制备了HLA—A*0201-WTl四聚体。
在制备了HLA—A*0201一PRl和HLA—A*0201-WTl四聚体后，用其检测20例接受HLA相合非清髓异基因造血干细胞移植(allo—NST)或传统化疗的恶性血液病患者PBMC中是否存在PRl特异性CTL和WTl特异性CTL。结果显示：在4例HLA-A*0201阴性患者PBMC中未检测到PRl特异性CTL和WTl特异性CTL；在HLA—A*0201阳性的1例非霍奇金淋巴瘤和1例多发性骨髓瘤患者PBMC中未检测到PRl特异性CTL和WTl特异性CTL。5例HLA-A,0201阳性且接受了NST获得完全细胞遗传学缓解的CML患者PBMC中检测到0．87％-1L92％的PRl特异性CTL，1．70％-5．44％的WTl特异性CTL；而3例HLA-A*0201阳性仅接受化疗的CML患者未检测到特异性CTL。4例HLA-A*0201阳性，NST后持续完全缓解的AML患者PBMC中检测到O．25％-3．34％的PRl特异性CTL，O．58％-1．60％的WTl特异性CTL；2例HLA-A*0201阳性仅接受化疗的AML患者PBMC中检测到低比例的PRl特异性CTL和WTl特异性CTL。这一结果表明，P3和WTl是重要的白血病相关抗原，PRl特异性CTL和WTl特异性CTL可能在NST受者体内得到扩增，并有助于患者的缓解。
结论：成功制备了HLA-A*0201-PRl和HLA-A*0201-WTl四聚体，并将其应用于NST后HLA-A*0201阳性的白血病患者PBMC中PRl特异性CTL和WTl特异性CTL的检测。HLAI类分子一白血病相关抗原肽四聚体有可能成为临床评价和监测GVL效应强度的有力工具。