研究背景:为了满足胚胎生长发育所需,妊娠期间多种器官发生协调性生理适应。这些广泛存在的母体生理变化与胎盘和胎儿的发育和生长高度协调,对妊娠的成功建立和维持至关重要。既往研究表明,妊娠期血脂逐渐升高。肝脏作为脂质代谢的关键器官,其脂质代谢在妊娠期间发生了剧烈变化。例如在生殖过程中肝细胞脂质摄取转运能力及TG分泌水平上调;肝X受体(LXR)靶点通过增加肝脏脂肪酸合成酶(FASN)和硬脂酰辅酶a去饱和酶1(SCD1)的表达,促进妊娠早期脂肪生成。而脂代谢异常常伴随不良妊娠结局,影响母婴健康。内质网应激是细胞应对刺激的一种保护性反应机制,即内质网应激时,生存途径一未折叠蛋白反应(UPR)会被激活。内质网应激包括三条通路:IRE1 α通路,PERK通路和ATF 6 α通路。当外界因素刺激引起内质网应激时,BIP立刻与这三条通路的跨膜蛋白分离,结合内质网腔内的未折叠蛋白;各自感应应激信号后发挥效应,进而对细胞进行保护。有证据表明内质网应激是脂肪肝的特征。有研究报道牛肝内的内质网应激相关蛋白在产犊前表达量增加。成纤维细胞生长因子-21(FGF21)是在2000年作为在FGF家族中的一员被发现并命名的,属于具有激素样作用的FGF亚家族。血清FGF21主要由肝脏分泌,可随血液到达胰腺、脂肪等组织,可产生一系列的作用,包括体重减低,改善胰岛素敏感性。在高酮体状态下,血清FGF21分泌骤增,酮体包含了β-羟丁酸、丙酮和乙酰乙酸。已有研究报道过,敲除FGF21已被证明通过抑制β氧化导致了肝脏脂肪变性。最近,新型代谢激素FGF21被发现在奶牛泌乳期或小鼠妊娠后期突然增加。近年来,肝脏脂质代谢机制研究不断进展,然而关于妊娠期脂质代谢的调控机制还未有明确报道。对妊娠期脂代谢机制进一步阐释,有助于降低不良妊娠发生率。研究目的:本实验旨在评估妊娠期小鼠肝脏脂质代谢情况,探究小鼠肝脏内质网应激和FGF21分泌增加与肝脏脂质代谢变化是否相关。研究方法:1.建立妊娠小鼠模型:从维通利华购入8周龄健康雌性和雄性C57BL/6小鼠,适应性喂养1周后,将雌鼠用随机数表法分为未孕组和妊娠组,每日傍晚将雌鼠和雄鼠按照2:1合笼饲养,合笼后清晨通过检查阴道栓确认妊娠(本研究将阴栓出现当日作为妊娠第1天)。妊娠组小鼠根据处死时妊娠期长短不同,分为妊娠第5天组(P5),妊娠第12天组(P12),妊娠第19天组(P19)及泌乳第2天组。2.利用代谢笼评估小鼠机体能量代谢水平:将所有妊娠晚期小鼠称重,在动物监测室(PhenoMaster,TSE Systems,Germany)适应24小时后连续测量2天的耗氧量(VO2)、二氧化碳产量(VCO2)、呼吸交换率(RER)和产热。3.血脂含量和β-羟丁酸使用Beckman化学分析仪测定,利用ELISA检测血清FGF21水平。组织甘油三酯、总胆固醇及游离胆固醇含量分析试剂盒测定小鼠肝脏组织脂质含量,油红O染色评估小鼠肝组织脂质积聚状况。4.实时荧光定量PCR及PCR array:用于妊娠期糖脂代谢相关差异基因筛选,及检测FGF21及其受体和FGF21分泌等相关分子变化。5.肝脏蛋白提取及Western blot检测各种脂质代谢及内质网应激相关蛋白表达水平。结果:1.妊娠期间小鼠血脂谱及肝脏脂质含量变化妊娠会导致身体和肝脏体重增加,尤其是在妊娠后期。雌性小鼠分娩后体重下降非常快,而肝脏重量变化不明显。与未孕组小鼠相比,妊娠第12天组和妊娠第19天组小鼠TG水平均明显升高。而TC和HDL-C在妊娠第12天时达到了最低水平,然后缓慢上升。为了进一步检测肝脏的潜在变化,我们检测了肝脏组织的脂质含量。与未孕组小鼠相比,妊娠第12天组和妊娠第19天组肝脏TG含量明显升高,同时妊娠第19天组肝脏胆固醇含量升高。HE和油红O染色结果与肝脂测定结果相一致,在妊娠后期肝脏出现更多的脂滴和气球样变。总之,小鼠妊娠早中期血清TG含量增加,肝脏脂质逐渐积累,妊娠晚期趋于稳定,而分娩后血清TG迅速下降,肝脏脂肪变性迅速好转。2.妊娠晚期小鼠机体能量代谢水平明显增加为评价妊娠对机体能量代谢的影响,我们采用代谢笼法测定能量消耗。与未孕组小鼠相比,妊娠晚期组小鼠显示VO2、VCO2和产热明显增加,而RER下降,提示脂肪酸β氧化增强。在妊娠小鼠肝脏中,脂肪酸被氧化为酮体,酮体是胚胎在葡萄糖供给缺乏时的重要能量来源,即妊娠晚期小鼠机体能量代谢水平明显增加,满足了胎儿生长发育所需。3.肝脏合成代谢在妊娠早期增强,在妊娠晚期受到明显抑制妊娠过程中TG代谢基因的表达呈明显的双相模式。在妊娠早期,FASN和SREBP1C的转录和蛋白水平显著升高。相反,在妊娠晚期,SREBP1C、FASN和SCD1的mRNA水平和蛋白丰度显著降低。同时β氧化相关基因包括CPT1α,hadha,ACOX1,Ech1,Ehhadh和Mlycd在妊娠晚期增加。与妊娠第12天组和妊娠第19天组小鼠之间肝脏TG没有增加相一致。通过微阵列分析发现妊娠晚期组与未孕组小鼠肝脏基因表达发生了变化,其中显示了一系列脂质合成相关基因表达下调。脂质合成相关基因变化最显著是SCD1,妊娠晚期与V组相比,SCD1的表达明显下调19倍。4.妊娠早期内质网应激被激活WB结果显示妊娠第5天相较于未孕或妊娠第19天时,BIP、IRE、PERK和eIF2a的磷酸化水平升高,表明这三个ER应激分支或许都被激活。对比小鼠妊娠第5天肝脏甘油三酯含量和脂滴无显著增加,直至妊娠第12天出现肝脏脂肪变性。这揭示了在我们的孕鼠模型中,内质网应激的发生或早于肝TG的积累。5.妊娠晚期高酮体状态下肝脏FGF21分泌增加在妊娠晚期,我们观察到血清酮体水平显著升高,血清FGF21从未孕到妊娠19天由略高于100 pg/ml增加到接近6000 pg/ml,到泌乳第2天时恢复到V组水平。同时,在妊娠第19天时,FGF21基因的mRNA表达水平显著增加30倍以上,并在泌乳第2天恢复到先前未孕时水平。令人惊讶的是,妊娠后期肝脏FGF21蛋白水平几乎检测不到,这可能与FGF21分泌迅速增加有关。肝细胞内的FGF21的合成过程属于细胞内膜泡运输,因此我们测量了内质网和高尔基体之间分泌囊泡的基因表达,包括Yipf6、Yipf5、Sarla、Sec23a、Sec24a、Sec31a 和 sec13。其中启动COPII被膜组装的小GTPase sec23a在妊娠后期增加。提示妊娠晚期FGF21极大可能通过COPII分泌入血,导致血清FGF21含量剧增。结论及意义:随着妊娠期内质网应激的激活和FGF21分泌的增加,肝脏甘油三酯含量在妊娠早中期快速累积,妊娠晚期趋于平稳,提示内质网应激和FGF21可能在平衡脂质稳态和满足妊娠后期母婴能量需求方面发挥重要作用。