【摘 要】
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第一部分 pGEX-4T-1-Con1-NS5A-35-215质粒的构建和GST融合蛋白的表达目的 设计、构建pGEX-4T-1-Con1-NS5A-35-215质粒,提取和纯化GST-Con1-NS5A-35-215 融合蛋白。方法 本实
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第一部分 pGEX-4T-1-Con1-NS5A-35-215质粒的构建和GST融合蛋白的表达目的 设计、构建pGEX-4T-1-Con1-NS5A-35-215质粒,提取和纯化GST-Con1-NS5A-35-215 融合蛋白。方法 本实验以p3× FLAG-CMV14-Con1-NS5A质粒为模版,PCR扩增Con1-NS5A-35-215片段,将扩增PCR产物酶切回收纯化后克隆到pGEX-4T-1载体的SmaⅠ和NotⅠ位点之间,获得重组质粒pGEX-4T-1-Con1-NS5A-35-215。转化大肠杆菌感受态细胞(DH5a),涂布LB培养板,挑取阳性克隆单菌落,提取质粒,进行菌落PCR验证和双酶切以及质粒DNA测序鉴定阳性克隆质粒,筛选正确的重组质粒。转化大肠杆菌感受态细胞(DE3),诱导和纯化GST-Con1-NS5A-35-215融合蛋白。结果 经过菌落PCR、双酶切鉴定和DNA测序证实成功构建pGEX-4T-1-Con1-NS5A-35-215质粒,并成功提取纯化目的GST融合蛋白。结论构建的重组质粒和提取的GST融合蛋白可以用于下一步实验,为研究该蛋白的宿主相互作用蛋白提供必需的工具,奠定基础。第二部分GST pull down联合质谱筛选丙肝病毒蛋白NS5A结构域I的相互作用蛋白目的通过对1b型丙肝病毒Con1株的NS5A结构域I宿主相互作用蛋白的鉴定分析,为研究NS5A功能及其参与病毒复制机制提供理论基础。方法采用GST pull down实验技术联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对Con1-NS5A-35-215相互作用的宿主蛋白进行鉴定,并使用Omics Bean在线软件对Con1-NS5A-35-215相互作用宿主蛋白进行GO功能富集分析和信号通路分析。为了确认生物信息学分析结果,采用GST pull down和免疫印迹实验技术对ACBD3和Vps35的相互作用关系进行验证。结果在Huh7.5.1细胞裂解液中鉴定到547个潜在相互作用宿主蛋白。GO功能富集分析发现相互作用蛋白主要参与细胞的运输、应激反应、凋亡、蛋白泛素化等生物学过程。信号通路分析发现相互作用蛋白主要参与蛋白酶体、糖代谢、氨基酸合成、RNA转运等通路。同时,GST pull down和免疫印迹实验证明了Con1-NS5A-35-215 可以 ACBD3 和 Vps35 结合。结论 NS5A结构域I通过其相互作用蛋白参与多种生物学过程,如调控细胞内运输、应激反应、蛋白稳态等过程。但是,其具体的功能及机制尚需要进一步的研究。而其中的宿主蛋白ACBD3和Vps35同丙肝病毒蛋白NS5A结构域Ⅰ具有直接的相互作用关系。
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