胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是成人中枢神经系统中一种最为常见的原发性恶性肿瘤,其发病率约占所有颅内肿瘤的12-15%。GBM治疗的主要方式是手术、放疗和化疗。由于血脑屏障,替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）是目前临床最常使用的化疗药物。引起GBM耐药性的一个重要因素是胶质母细胞瘤干细胞（Glioblastoma stem cell,GSC）。已有许多文献报道GSC参与GBM抵抗TMZ的调控机制。蛋白质翻译后修饰通过影响蛋白质的构象、活性以及功能参与多种生物学过程,棕榈酰化修饰是一种由棕榈酰基转移酶介导的蛋白质翻译后修饰方式,异常修饰导致的蛋白质功能变化与肿瘤等疾病密切相关,但在GBM发生、进展,以及放化疗抵抗中的功能仍不清楚。在本研究中,我们通过大数据挖掘分析,结合临床样本验证,发现胶质瘤组织中的棕榈酰基转移酶ZDHHC4具有高丰度的表达。ZDHHC4的表达与胶质瘤患者的恶性程度呈正相关,高表达ZDHHC4的患者生存期相对更短。为探究ZDHHC4在胶质瘤进展中的具体调控机制,我们利用免疫共沉淀实验鉴定并证明GSK3β是ZDHHC4的特异性棕榈酰化修饰底物。GSK3β是一种丝氨酸蛋白激酶,GSK3β激酶活性主要受到激酶结构域的Tyr216位点的磷酸化调控,并通过磷酸化修饰其底物介导的级联传递,导致生物学功能改变。GSK3β蛋白的翻译后修饰是重要的激酶活性调节模式,我们首次鉴定GSK3β第14位半胱氨酸残基（Cys14）被ZDHHC4棕榈酰化修饰。且ZDHHC4通过与GSK3β上游的修饰激酶AKT1和p70S6K竞争性结合,抑制GSK3β的p-Ser9修饰而增强p-Tyr216位点磷酸化。表明ZDHHC4介导的棕榈酰化修饰改变了 GSK3β的激酶活性,并引起GBM细胞的恶性生物学表型。在细胞学水平,通过增强或抑制ZDHHC4的表达,结果表明高水平的ZDHHC4增加GBM细胞的TMZ治疗抗性。同时,ZDHHC4的沉默或过表达棕榈酰化失活的GSK3β（C14A）突变体,有助于提高GBM细胞的TMZ敏感性。筛选TMZ耐受的GBM细胞株,与正常细胞比较发现TMZ耐药细胞中的ZDHHC4表达上调,伴随GSK3β棕榈酰化修饰增强其p-Tyr216磷酸化激活,使得GBM细胞的增殖、迁移,以及GSC的自我更新能力提升,进而促使GBM细胞的TMZ耐药能力上调。为进一步探索ZDHHC4介导的GSK3β棕榈酰化修饰,以及下游信号轴调控GBM的TMZ耐药分子作用机制。利用蛋白质芯片分析发现下游STAT3信号通路与ZDHHC4表达呈密切正相关。在TMZ耐药细胞中,ZDHHC4-GSK3β-STAT3通路持续性激活。棕榈酰化修饰的GSK3β可与细胞内STAT3结合,并提高其Tyr705位点磷酸化。主要是GSK3β通过促进EZH2的Ser21的磷酸化修饰,改变了 STAT3的Lys180的甲基化水平来实现的。此外,转录因子STAT3的活性增强,也可通过结合ZDHHC4的启动子序列提升ZDHHC4表达,使得ZDHHC4-GSK3β-STAT3之间形成正反馈调节环路。综合以上数据,表明ZDHHC4介导的GSK3β棕榈酰化修饰,通过激活EZH2/STAT3信号轴来提高GBM细胞的TMZ耐药性。为验证信号轴传递,利用化学生物学方法,通过靶向GSK3β的特异性小分子抑制剂Niclosamide处理GBM细胞。在体外,Niclosamide处理的GBM耐药细胞中STAT3的活性明显降低,有效抑制GSC干细胞成球能力,并促进凋亡。细胞学实验证实,ZDHHC4表达抑制,GSK3β的棕榈酰修饰抑制,以及对耐药GBM细胞使用Niclosamide处理,都能显著抑制肿瘤生长。同时,通过建立小鼠颅内移植瘤模型,降低ZDHHC4的表达,或联合作用GSK3β小分子抑制,可以抑制GSK3β/STAT3信号轴,从而增强TMZ的肿瘤杀伤效果,暗示ZDHHC4可以作为一个潜在作用靶点,以及GSK3β/STAT3可作为TMZ耐药GBM细胞的干预靶标,为潜在的临床应用提供理论支持。综上所述,本研究揭示了 ZDHHC4介导的GSK3β棕榈酰化修饰,通过激活EZH2-STAT3信号轴,增强GSC自我更新能力和GBM细胞TMZ耐药性。这有助于进一步理解GBM治疗后的耐药及复发机制,也为蛋白质棕榈酰化修饰在GBM恶性化进展中调控机制提供了新的理论基础。