【摘 要】
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研究背景:流行性感冒病毒（influenza virus）是影响人类健康最严重的传染病之一,流感的大爆发不但对人民生命安全造成极大损害,而且也严重阻碍社会经济的发展。流感传播速度快、影响范围广、发病率和死亡率高。由于抗原漂移和抗原转移导致目前的疫苗并不能有效的预防新发流感病毒的传播,因此抗流感病毒药物的作用显得尤为重要。目前FDA通过的抗流感药物分别是以金刚烷胺为代表的M2离子通道抑制剂、以奥司他
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81728007）；
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研究背景:流行性感冒病毒（influenza virus）是影响人类健康最严重的传染病之一,流感的大爆发不但对人民生命安全造成极大损害,而且也严重阻碍社会经济的发展。流感传播速度快、影响范围广、发病率和死亡率高。由于抗原漂移和抗原转移导致目前的疫苗并不能有效的预防新发流感病毒的传播,因此抗流感病毒药物的作用显得尤为重要。目前FDA通过的抗流感药物分别是以金刚烷胺为代表的M2离子通道抑制剂、以奥司他韦为代表的神经氨酸酶抑制剂、以阿比朵尔为代表的血凝素抑制剂和以巴洛沙韦为代表的帽依赖性核酸内切酶抑制剂。然而临床上已经出现了对这几类药物具有耐药性的病毒株,因此开发稳定、安全且有效的新型抗流感病毒药物的任务迫在眉睫。流感病毒RNA聚合酶基因序列相较血凝素基因序列和神经氨酸酶基因序列的保守性更高,近年成为设计抗流感病毒药物的潜在靶点。前期实验中,本课题组与华南农业大学宋高鹏副教授进行合作对合成的小分子化合物基于细胞水平上进行活性筛选,发现了以YX-48-26为代表的四氢罂粟碱衍生物具有潜在的体外抗甲型流感病毒活性。研究目的:四氢罂粟碱是植物罂粟中主要生物碱成分罂粟碱的1、2、3、4-四氢化物。有报道称D,L-氢溴酸劳丹素具有抗流感病毒活性,推测其活性机制可能与其四氢罂粟碱母核结构有关。本文通过研究四氢罂粟碱衍生物YX-48-26抗流感病毒活性,探究其作用机制,为接下来开发具有临床前意义的抗流感病毒药物提供新思路。研究方法:1.MTT法测定四氢罂粟碱衍生物的抗病毒活性和细胞毒性。2.YX-48-26对MDCK和A549细胞活力的影响,MTT法结合空斑实验检测YX-48-26对流感病毒抑制作用的影响。3.使用蛋白印迹法（Western blotting）、间接免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）以及实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）评价YX-48-26对于流感病毒复制的影响。4.使用H5N1假病毒抑制实验、血凝抑制实验和神经氨酸酶（NA）抑制实验探讨YX-48-26对流感病毒进入宿主或子代病毒释放的影响;利用Time-of-addition和 mini-replicon 实验确定 YX-48-26 作用的具体阶段。5.通过免疫共聚焦、表面等离子体共振（SPR）技术和分子对接（Docking）确定YX-48-26的作用靶点。实验结果:1.筛选出13种具有抗病毒活性的四氢罂粟碱衍生物,IC50介于0.6-13μM之间。2.YX-48-26可以抑制A/WSN/1993（H1N1）亚型病毒的感染,在MDCK和A549细胞中的IC50分别为2.0± 0.8 μM和7.5±2.8 μM。同时对于MDCK和A549细胞保持较低的细胞毒性。3.YX-48-26不能抑制由病毒引起的血凝反应和H5N1假病毒感染,也对NA活性并无影响。4.YX-48-26在细胞感染后0-8小时抑制病毒的复制。5.YX-48-26能够降低流感病毒vRNP活性,影响cRNA和病毒RNA的合成。6.YX-48-26 与 PAN蛋白双金属 Mn2+、Asp108、Lys137、Ile38、Ala37 和Lys34特异性结合。7.YX-48-26能够影响PA蛋白入核,使其主要集中于细胞质。实验结论:四氢罂粟碱衍生物YX-48-26通过抑制流感病毒的基因组的转录与复制而抗病毒。其抗病毒作用靶点为RNA聚合酶的PAN结构域,通过抑制流感病毒PA蛋白的入核,阻断流感病毒“帽攫取”的过程从而抑制病毒mRNA转录和病毒蛋白合成,同时干扰病毒RNA与互补RNA的启动子结合,阻止病毒RNA的复制。
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