论文部分内容阅读
研究背景及目的:胶质瘤(glioma)是最为常见的中枢神经系统恶性肿瘤,具有较高的侵袭性,边界不清晰,故单纯的手术切除无法达到治疗效果。大量的研究表明,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及与其逆反的间质-上皮转化(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)与肿瘤的发生发展之间存在一定的联系。EMT能够促进肿瘤的远端转移与异位侵袭,而MET能够促进肿瘤细胞的增殖与分化。白藜芦醇(resveratrol,Res)是具有抗癌作用的天然多酚类化合物,对胶质瘤具有一定的抗肿瘤作用。本实验室前期的蛋白质组学数据的分析表明,胶质母细胞瘤细胞系经白藜芦醇处理后,角蛋白17(KRT 17)的表达水平明显下调。因KRT 17是上皮性肿瘤的标志物,说明白藜芦醇能够降低胶质母细胞瘤中上皮特性分子的异常高表达。因此,本实验旨在证明人胶质瘤中具有间质-上皮转化的倾向,并分析胶质母细胞瘤细胞系中白藜芦醇对间质-上皮转化的调节作用。具体研究内容如下:1.检测KRT 17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在胶质瘤组织中的表达情况,并分析它们与肿瘤分级之间的相关性;2.分析KRT 17与E-cadherin之间的相关性;3.检测胶质母细胞瘤细胞系LN428、LN18及U251对白藜芦醇的敏感性;4.检测白藜芦醇处理前后,LN428、LN18及U251中KRT 17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin中的表达情况;5.检测β-catenin在LN428、LN18及U251中的核易位情况及白藜芦醇对其的作用;6.揭示胶质瘤组织中MET的倾向,以及白藜芦醇对这一倾向的逆转作用与意义。方法:利用石蜡组织微阵列技术及免疫组织化学染色(IHC)检测KRT 17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在95例人胶质瘤组织中的表达情况,并利用SPSS18对它们与肿瘤分级之间的关系以及KRT 17与E-cadherin、β-catenin之间的相关性进行统计学分析;采用H-E染色和MTT法检测胶质母细胞瘤细胞系LN428、LN18及U251对于白藜芦醇的药物敏感性;通过RT-PCR、免疫细胞化学(ICC)、Western-blotting方法检测,100μM白藜芦醇处理48小时前后,KRT 17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin的表达情况;采用免疫荧光技术(IF)检测β-catenin在LN428、LN18及U251中的核易位情况及白藜芦醇对其的影响。结果:1.胶质瘤组织中KRT 17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin的IHC检测:(1)阳性率比较:KRT17、E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在胶质瘤组织中的阳性率分别为67.8%、27.8%、100%、92.2%,瘤旁组织中的阳性率分别为0%、20%、100%、60%,其中KRT 17和β-catenin在胶质瘤中的阳性率高于瘤旁组织。(2)与肿瘤分级的相关性分析:β-catenin的表达水平与胶质瘤分级间呈正相关(p=0.045,r=0.212);KRT 17(p=0.493,r=0.028)、E-cadherin(p=0.474,r=-0.017)、N-cadherin(p=0.499,r=0.014)与胶质瘤分级间的相关性分析均不具有统计学意义。(3)KRT 17与E-cadherin的表达水平之间呈正相关,具有显著的统计学意义(p=0.023,r=0.232)。2.白藜芦醇敏感性的检测:HE染色和MTT法的结果显示,LN428在经过白藜芦醇处理后,细胞数目基本不变,细胞形态无明显变化,具有耐药性;LN18加药后,细胞数目略有减少,形态变化不明显,不具有绝对的敏感性;U251加药后,细胞数目大量减少,形态发生明显变化,对于白藜芦醇十分敏感。3.MET相关分子表达情况的检测:(1)细胞骨架蛋白KRT 17:LN428中呈强阳性表达,经白藜芦醇处理后,其PCR、ICC及Western的结果均显示表达水平明显下调;在LN18和U251中呈近阴性表达。(2)上皮标志物E-cadherin:LN428中呈阳性表达,加药后表达水平略有下调;LN18的PCR结果显示其有表达,但ICC及Western显示阴性表达;U251中呈阴性表达。(3)间质标志物N-cadherin:在LN428、LN18及U251中都呈阳性表达,LN428中表达水平下调;LN18中表达基本无差异;U251的PCR显示无差异,ICC及Western显示表达略有下调。(4)连环蛋白β-catenin:LN428中呈阳性表达,加药后PCR显示不变,ICC及Western显示表达水平下调;LN18及U251中弱表达,无明显差异。4.IF检测结果显示,LN428中发生了β-catenin的核易位,在经过白藜芦醇处理后其核内β-catenin的表达水平下调。结论1.KRT17、E-cadherin在胶质瘤组织中的阳性率分别为67.8%、27.8%,高于瘤旁组织中的阳性率0%、20%;这些上皮标志分子表达的增强,提示胶质瘤中具有间质-上皮转化的倾向。2.β-catenin的表达水平与胶质瘤分级间呈正相关(p=0.045,r=0.212),说明随着肿瘤恶性程度的增加,其增殖的能力也随之增强;KRT 17与E-cadherin的表达之间呈正相关(p=0.023,r=0.212),提示这两种上皮标志物之间具有一定的联系。3.经白藜芦醇处理后,胶质母细胞瘤细胞系中KRT 17、E-cadherin的表达水平降低,说明其上皮特性减弱,向间质特性转化;N-cadherin及核易位的β-catenin的表达水平降低,说明白藜芦醇在逆转其间质-上皮转化的同时,诱导肿瘤细胞凋亡,并抑制其增殖,从而发挥抗癌效应。4.不同白藜芦醇敏感性的胶质母细胞瘤细胞系,在经过加药处理之后,其上皮特性均发生不同程度的减弱,说明白藜芦醇对于不敏感的细胞系具有同样的作用,能够诱导其重新获得胶质细胞的间质特性。5.推测胶质瘤中具有间质-上皮转化的倾向,而白藜芦醇能够逆转这一转化过程,促进其向间质性细胞的分化。