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柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)为长线形病毒科(Closteroviridae)长线形病毒属(Closterovirus)的成员，其主要侵染芸香科中的柑橘属以及多个柑橘属近缘物种，引起的柑橘衰退病是威胁柑橘产业的严重病害。目前CTV与寄主互作的研究较少，本实验室前期鉴定到柑橘脱水素蛋白COR15和亲免蛋白FKBP17-2可能与CTV编码的p20和p23互作，本研究以此为基础，分析了这些互作蛋白的生物学功能，同时还对来源于CTV的vsiRNA靶向甜橙基因进行了分析，从蛋白水平以及核酸水平解析CTV与寄主之间的互作。主要研究结果如下：
⑴采用分裂泛素化酵母系统(DUALmembrane)和双分子荧光互补(BiFC)试验确认了CTV编码的p20与甜橙脱水素蛋白CtCOR15和本氏烟脱水素蛋白NbCOR15的互作，p20与CtCOR15和NbCOR15在本氏烟细胞内互作产生大量的颗粒状的聚集体。在本氏烟16c叶片上诱导gfp基因的沉默试验，结果显示CtCOR15蛋白的表达促进了gfp基因的沉默，同时还能减弱p20沉默抑制作用。对本氏烟16c叶片诱导沉默的接种区进行sRNA测序，发现CtCOR15蛋白的表达仅增加了gfp-sRNA的产生，而p20蛋白的表达不仅抑制了gfp-sRNA的产生，还导致gfp-sRNA的5′端‘U’所占的比例降低了21%，初步推测CtCOR15和p20影响参与RNA沉默扩增阶段重要蛋白SGS3的功能。p20和CtCOR15互作复合体与SGS3的亚细胞定位分析发现p20-CtCOR15互作复合体与SGS3共定位在细胞核附近，BiFC试验进一步确认p20和CtCOR15可与SGS3在烟草细胞中互作。在VIGS诱导本氏烟NbCOR15基因沉默的本氏烟植株上接种CTV侵染性克隆，对CTVcp基因进行荧光定量分析，CTVcp基因的表达水平相比对照植株增加了1.8-8倍，说明NbCOR15的沉默有利于CTV的积累。Westernblot试验证明p20会导致NbSGS3蛋白的降解，利用自噬标记物ATG8和细胞电镜观察，发现表达p20蛋白诱导了细胞自噬的发生，进一步分析发现p20、SGS3和ATG8三者定位在自噬体，推测p20利用细胞自噬途径降解NbSGS3蛋白，进而起到沉默抑制子的作用。
⑵分裂泛素化酵母系统和BiFC试验发现CTV编码的p23蛋白与墨西哥梾檬和本氏烟FK506结合蛋白(CaFKBP17-2和NbFKBP17-2)互作，在试验中p23与CaFKBP17-2和NbFKBP17-2互作荧光信号定位在本氏烟细胞的胞间连丝。亚细胞定位发现p23定位在胞间连丝，与已报道的p23定位结果相同，NbFKBP17-2定位在叶绿体，与拟南芥中的同源基因的亚细胞定位相同，当p20和NbFKBP17-2共表达时，p23使NbFKBP17-2的定位由叶绿体变为胞间连丝。BiFC试验发现NbFKBP17-2还可与CTV外壳蛋白CP互作，NbFKBP17-2/CP的互作复合体在细胞内沿内质网运动。p23与NbFKBP17-2/CP互作复合体的亚细胞定位结果显示，p23除了与NbFKBP17-2/CP互作复合体在胞内运动，还引导NbFKBP17-2/CP互作复合体沿细胞膜运动。在VIGS诱导本氏烟NbFKBP17-2基因沉默的本氏烟植株上接种CTV侵染性克隆，与对照接种植株比较，CTV的积累量降低了约2倍，观察本氏烟叶片，发现仅当本氏烟的FKBP17-2被沉默，且接种CTV时，本氏烟的新叶才会表现褪绿症状。综上所述，p23和NbFKBP17-2参与CTVCP蛋白的胞内运动。
⑶利用小RNA、降解组和转录组测序，对来源于CTV-S45分离物的vsiRNA进行分析，寻找靶向甜橙基因的vsiRNA。小RNA数据分析结果显示，CTV的侵染改变了甜橙sRNA的组成，CTV侵染后的甜橙样品中的sRNA长度以21和22nt为主，对照柑橘样品中的sRNA长度以24nt为主。预测CTV的vsiRNA的靶向基因，发现662,051条vsiRNA可能参与靶向了594个柑橘基因的mRNA，这些基因主要参与内质网蛋白加工、内吞作用和苯丙烷生物合成等生物途径。转录组测序发现参与甜橙木质素合成途径的重要基因苯丙氨酸裂解酶(PAL)在CTV-S45侵染后下调了249倍，在降解组数据中，并未找到CTV的vsiRNA反向互补靶向PAL基因的证据，说明PAL的下调表达可能不是vsiRNA导致的。降解组数据显示来源于CTV-S45基因组18868位置的vsiRNA18868靶向柑橘基因Cs8g05320，Cs8g05320编码UDP葡萄糖基转移酶参与植物的抗病过程。RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增和荧光素酶报告试验进一步证明vsiRNA18868在1132-1133和1133-1134位点特异性的剪切甜橙基因Cs8g05320的mRNA，此外，转录组分析结果显示Cs8g05320基因的表达下调了6.77倍，推测CTV利用自身的vsiRNA18868下调Cs8g05320基因的表达，导致甜橙的抗病性降低。
⑴采用分裂泛素化酵母系统(DUALmembrane)和双分子荧光互补(BiFC)试验确认了CTV编码的p20与甜橙脱水素蛋白CtCOR15和本氏烟脱水素蛋白NbCOR15的互作，p20与CtCOR15和NbCOR15在本氏烟细胞内互作产生大量的颗粒状的聚集体。在本氏烟16c叶片上诱导gfp基因的沉默试验，结果显示CtCOR15蛋白的表达促进了gfp基因的沉默，同时还能减弱p20沉默抑制作用。对本氏烟16c叶片诱导沉默的接种区进行sRNA测序，发现CtCOR15蛋白的表达仅增加了gfp-sRNA的产生，而p20蛋白的表达不仅抑制了gfp-sRNA的产生，还导致gfp-sRNA的5′端‘U’所占的比例降低了21%，初步推测CtCOR15和p20影响参与RNA沉默扩增阶段重要蛋白SGS3的功能。p20和CtCOR15互作复合体与SGS3的亚细胞定位分析发现p20-CtCOR15互作复合体与SGS3共定位在细胞核附近，BiFC试验进一步确认p20和CtCOR15可与SGS3在烟草细胞中互作。在VIGS诱导本氏烟NbCOR15基因沉默的本氏烟植株上接种CTV侵染性克隆，对CTVcp基因进行荧光定量分析，CTVcp基因的表达水平相比对照植株增加了1.8-8倍，说明NbCOR15的沉默有利于CTV的积累。Westernblot试验证明p20会导致NbSGS3蛋白的降解，利用自噬标记物ATG8和细胞电镜观察，发现表达p20蛋白诱导了细胞自噬的发生，进一步分析发现p20、SGS3和ATG8三者定位在自噬体，推测p20利用细胞自噬途径降解NbSGS3蛋白，进而起到沉默抑制子的作用。
⑵分裂泛素化酵母系统和BiFC试验发现CTV编码的p23蛋白与墨西哥梾檬和本氏烟FK506结合蛋白(CaFKBP17-2和NbFKBP17-2)互作，在试验中p23与CaFKBP17-2和NbFKBP17-2互作荧光信号定位在本氏烟细胞的胞间连丝。亚细胞定位发现p23定位在胞间连丝，与已报道的p23定位结果相同，NbFKBP17-2定位在叶绿体，与拟南芥中的同源基因的亚细胞定位相同，当p20和NbFKBP17-2共表达时，p23使NbFKBP17-2的定位由叶绿体变为胞间连丝。BiFC试验发现NbFKBP17-2还可与CTV外壳蛋白CP互作，NbFKBP17-2/CP的互作复合体在细胞内沿内质网运动。p23与NbFKBP17-2/CP互作复合体的亚细胞定位结果显示，p23除了与NbFKBP17-2/CP互作复合体在胞内运动，还引导NbFKBP17-2/CP互作复合体沿细胞膜运动。在VIGS诱导本氏烟NbFKBP17-2基因沉默的本氏烟植株上接种CTV侵染性克隆，与对照接种植株比较，CTV的积累量降低了约2倍，观察本氏烟叶片，发现仅当本氏烟的FKBP17-2被沉默，且接种CTV时，本氏烟的新叶才会表现褪绿症状。综上所述，p23和NbFKBP17-2参与CTVCP蛋白的胞内运动。
⑶利用小RNA、降解组和转录组测序，对来源于CTV-S45分离物的vsiRNA进行分析，寻找靶向甜橙基因的vsiRNA。小RNA数据分析结果显示，CTV的侵染改变了甜橙sRNA的组成，CTV侵染后的甜橙样品中的sRNA长度以21和22nt为主，对照柑橘样品中的sRNA长度以24nt为主。预测CTV的vsiRNA的靶向基因，发现662,051条vsiRNA可能参与靶向了594个柑橘基因的mRNA，这些基因主要参与内质网蛋白加工、内吞作用和苯丙烷生物合成等生物途径。转录组测序发现参与甜橙木质素合成途径的重要基因苯丙氨酸裂解酶(PAL)在CTV-S45侵染后下调了249倍，在降解组数据中，并未找到CTV的vsiRNA反向互补靶向PAL基因的证据，说明PAL的下调表达可能不是vsiRNA导致的。降解组数据显示来源于CTV-S45基因组18868位置的vsiRNA18868靶向柑橘基因Cs8g05320，Cs8g05320编码UDP葡萄糖基转移酶参与植物的抗病过程。RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增和荧光素酶报告试验进一步证明vsiRNA18868在1132-1133和1133-1134位点特异性的剪切甜橙基因Cs8g05320的mRNA，此外，转录组分析结果显示Cs8g05320基因的表达下调了6.77倍，推测CTV利用自身的vsiRNA18868下调Cs8g05320基因的表达，导致甜橙的抗病性降低。