【摘 要】
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稀有人参皂苷CK因具有多种药理特性如抗炎、抗过敏、抗衰老、抗糖尿病、保护肝脏和神经等而倍受关注。目前微生物法转化和酶法转化制备CK的底物成本高、转化周期长,难以满足应用需求。构建微生物细胞工厂从头合成是解决CK短缺的有效策略之一。本文在产CK酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）底盘细胞的基础上,为了提高CK产量,对合成CK的上游途径进行优化:（1）在酿酒酵母BY4742来源
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稀有人参皂苷CK因具有多种药理特性如抗炎、抗过敏、抗衰老、抗糖尿病、保护肝脏和神经等而倍受关注。目前微生物法转化和酶法转化制备CK的底物成本高、转化周期长,难以满足应用需求。构建微生物细胞工厂从头合成是解决CK短缺的有效策略之一。本文在产CK酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）底盘细胞的基础上,为了提高CK产量,对合成CK的上游途径进行优化:（1）在酿酒酵母BY4742来源的ERG20和ERG9两基因间加入柔性linker进行基因融合,利用overlap构建ERG20-ERG9融合盒子;（2）利用overlap构建金黄色葡萄球菌来源的HMGR小盒子;（3）利用吉普森组装在酵母体内高效重组p AUR112载体、URA3、HMGR和ERG20-ERG9四个片段,构建完整表达盒子;（4）把线性化的表达盒子转化到本课题组前期已对Pg DDS、CYP716A47、46t ATR1和UGTPg1进行密码子优化得到产人参皂苷CK的底盘酵母CK9;（5）发酵检验,检测CK和鲨烯产量。主要研究结果:（1）构建得到对ERG20、ERG9和HMGR这三个关键限速酶基因进行优化、两端带有酿酒酵母基因组δ序列的大小为6963 bp的表达盒子;（2）在上游途径优化的CK9-δUMEs菌株中,测得CK最高产量为64.40 mg/L,约为起始底盘酵母CK9产量19.18 mg/L的3.3倍;（3）分批补料发酵更利于产CK的酵母菌株生长、提高CK产量;（4）优化上游途径能较好地提高CK前体物质鲨烯的供应。结论:（1）在ERG20和ERG9基因间加入柔性linker进行基因融合可促进重组菌株合成CK;（2）获得优化上游途径后高产CK的稳定菌株CK9-δUME-46#。创新及意义:（1）创新点:（1）选用金黄色葡萄球菌来源的天然截短型HMGR基因,加上酿酒酵母BY4742来源的ERG20、ERG9基因共三个关键限速酶基因组合优化上游合成途径;（2）在ERG20和ERG9基因间加入柔性linker:Gly-Ser-T hr-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly进行基因融合。（2）意义:本实验针对ERG20、ERG9和HMGR三个基因的优化,能够提供较多的鲨烯以合成CK,所以后续对CK的优化研究可以着重于下游途径的细胞减毒。
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