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机体在遭受到有害刺激时,细胞中会呈现氧化应激反应,而体内的活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)就是其中一个重要指标,当自由基水平超标,机体自身抗氧化清除能力不足,使得氧化-抗氧化系统失衡,进而造成机体氧化损伤[1]。因此,实时动态检测活细胞内ROS变化显得尤为重要。目前,检测活细胞中ROS水平的方法有外源性和内源性两大方法体系,其中内源性探针有细胞毒性小、生物相容性好等优势,是目前ROS检测的发展趋势。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Epoxy Chloropropane Kelch Sample related Protein-1,Keapl)/核因子 E2 相关因子 2(Nuclear Factor Erythroid-2 related Factor 2,Nrf2)-抗氧化元件(Antioxidant Response Element,ARE)这样一条机体内内源性抗氧化信号通路[2]可以改造后作为内源性检测ROS的一条新的途径。当机体内ROS水平处于生理状态时,Keapl蛋白质介导Nrf2蛋白质泛素化降解;当机体受到外界刺激导致ROS水平升高时,Nrf2不再被Keap1介导降解,而是进入细胞核内激活ARE序列下游的抗氧化基因来抵抗氧化应激带来的损伤。因此,本研究将构建在基因水平上依靠于Keap1/Nrf2-ARE通路的基因编码的ROS检测荧光生物细胞传感器,以期进行环境毒物对人体造成的ROS损伤和肿瘤细胞氧化损伤的检测。本课题设计并构建成功基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性ROS细胞传感器,并对其工作性能和应用进行了检测。首先,将该ROS细胞传感器的各个元件通过基因编辑构建于质粒表达载体,分别选取mCherry和mNeonGreen荧光蛋白作为响应信号分别构建两种ROS细胞传感器。采用外源添加H202的方式测试构建成功的细胞传感器的性能。结果表明:在H202外源刺激条件下,与mCherry相比,mNeonGreen作为响应信号的传感器具有更高的响应性。前人研究表明紫杉醇和白藜芦醇会导致细胞的ROS水平升高,因此选用紫杉醇和白藜芦醇进行该ROS细胞传感器的实际应用测试工作。结果表明:低浓度的紫杉醇会造成细胞的ROS水平升高;白藜芦醇的浓度与荧光信号的灵敏度成正比例,高浓度的白藜芦醇会升高ROS水平。此外,将构建好的ROS细胞传感器转入白血病细胞HL-60中对其氧化损伤进行检测,实验表明肿瘤细胞的生理ROS水平比正常人体细胞高,高浓度H202外源刺激下,该ROS细胞传感器荧光信号显现的更明显。本研究具有良好的发展前景,可以通过荧光信号的量化,将其与ROS升高水平相关联,进行外源刺激与ROS的定量研究;可以将其应用于其他肿瘤细胞中,进一步推进肿瘤的检测工作;此外,Keapl/Nrf2-ARE信号通路在人体内氧化-抗氧化系统中具有重要意义,但仍有许多机制仍旧未知,本实验也为其工作机制的深入研究提供了一些基础性工作。