论文部分内容阅读
背景:慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(CP/CPPS)是泌尿外科和男性科门诊最常见的疾病,在男性人群中估计患病率在2-16%之间,主要患病年龄为35-45岁。CP/CPPS的疾病异质性高,病因尚未明确,涉及的生物学机制非常复杂,目前尚无确切的单一病因能够解释其发病机制。家族聚集性和双生子研究提示遗传因素在CP/CPPS的发生中扮演重要角色。同时CP/CPPS被认为是在遗传易感的基础上,多种环境因素作用下发生和发展的复杂性疾病,发病机制涉及感染、免疫和神经精神等多方面因素。最近的研究发现肠道菌群结构和丰度的改变与CP/CPPS存在显著相关性。外显子组芯片覆盖了推定的功能性外显子变异,具有通量高、覆盖面广、敏感度高、精确度高、成本低、效益高等优点,为研究复杂性疾病的遗传机制提供了强有力的工具。目标序列捕获测序是基于二代测序技术的高通量研究手段,利用较少的数据量就可以得到超高的灵敏度和准确度,快速筛选到遗传变异位点。肠道菌群宏基因组鸟枪法测序不仅可以分析肠道细菌的菌群结构还可以分析他们的基因功能。综合利用这些研究策略,可以对人体的遗传背景和肠道菌群的结构和功能在CP/CPPS的发生发展中可能发挥的重要作用进行全面研究。目的:本研究拟通过开展CP/CPPS的全外显子组关联分析及肠道微生物宏基因组学研究,结合目标区域捕获测序、基因通路富集、层次聚类等分析,初步探索宿主遗传易感性和肠道微生物在CP/CPPS复杂发病机制中扮演的角色,为制订基于疾病遗传易感位点和疾病相关肠道菌群结构的诊断模型提供理论依据,为指导个性化诊断和治疗提供证据支持。方法:采用Illumina Human Exome Bead Chip对纳入研究的1699例CP/CPPS患者和1647例健康对照进行全外显子组关联分析。然后对可能存在关联的目标区域进行区域捕获测序。同时结合公共数据库(Roadmap Epigenomics,ENCODE projects,KEGG,Bio Grid等)的数据,采用数量性状基因座(e QTL)分析、基因通路富集分析、通路聚类分析、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析等,进一步挖掘全外显子组关联分析和目标区域测序发现的遗传变异位点所在基因的相关功能。结果:单位点关联分析发现与CP/CPPS存在显著关联的是位于HLADQB2内含子上的rs7453920(MAF=0.08,P=8.78×10-9)以及位于基因间区域的rs527369852(MAF=0.263,P=6.01×10-8)。对P<10-5的遗传变异位点集中的6p21.32染色体区域(chr6:32427000-32454000)进行目标区域测序,发现位于HLA-DRB9上游的3个Indel(rs566122716,rs571840751,rs76318940)以及位于HLA-DRB9与HLA-DRB5基因间的32个SNP在病例及对照组之间频率分布不同,差异有显著统计学意义(均P<0.05)。对于P<10-3的240个位点,发现有e QTL效应的共128个位点,大部分集中在HLA区域。富集到的基因包括HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DRB5,HLA-DQA1,HLA-DQB1,IL6R,TNFSF11A,这些基因所在的通路与自身免疫功能密切相关(如同种异体移植排斥)。PPI富集分析提示HLA-DQB1,HLA-DQB2,HLA-DQA1,HLA-DRB1,HLA-DRB5可以聚类在一起,存在PPI。该聚类涉及的通路包括ZAP-70向免疫突触的易位、CD3和TCR zeta链的磷酸化、PD-1信号通路。小结:本研究发现HLA-DQB2与CP/CPPS易感性相关,区域测序研究发现3个Indel及HLDRB5,HLA-DRB9与CP/CPPS相关,丰富了中国人群CP/CPPS的遗传易感性研究结果,有助于提高对CP/CPPS发病机制的认识。方法:采用全基因组鸟枪法测序对34例CP/CPPS患者及32例健康对照进行肠道菌群宏基因组学研究。通过基因组序列组装分析、基因预测、宏基因组物种定位分析、宏基因组种群差异分析、生物通路注释及种群差异分析,研究肠道菌群的结构多样性及物种相对丰度与疾病之间的关系。进一步通过(partitioning around medoids with estimation of number of clusters)PAMK算法及(multidimensional scaling)MDS分析对菌群基因对应的代谢通路进行聚类,深入研究肠道菌群的功能模式。利用机器学习算法中的随机森林模型,筛选能区分代谢通路聚类以及疾病状态的肠道菌群,构建诊断模型。结果:CP/CPPS患者与健康对照的肠道菌群结构呈现差异分布,CP/CPPS患者肠道中是变形杆菌门(Proteobacteria)下属的大肠埃希菌属(Escherichia)为主的群落结构,而健康对照的肠道微生物群落结构则是以放线菌门(Actinobacteria)下属的丹毒丝菌属(Erysipelotrichaceae)为主。CP/CPPS患者肠道大肠埃希菌属(Escherichia)的相对丰度均显著高于对照组(P<0.05)。菌群基因对应的代谢通路中有33条通路存在差异表达,包括影响生化代谢及神经系统病变的相关通路(如三羧酸循环、阿尔兹海默症等)。通路聚类结果显示上述通路可以划分为2个聚类,其中健康对照的菌群对应的代谢通路聚类较为一致。CP/CPPS患者的肠道菌群除了参与健康对照类似的生物通路,还参与了一些显著不同于健康对照的生物通路,如药物代谢-其他酶、克拉维酸生物合成、细胞色素P450对外源生物的代谢等与药物代谢相关的生物通路。基于机器学习算法的诊断模型利用2种肠道细菌(Prevotella_copri和Escherichia_coli)对CP/CPPS和健康对照进行区分,预测的准确率达到77.3%。小结:本研究对CP/CPPS进行宏基因组学研究,发现CP/CPPS患者的肠道菌群结构与对照存在显著差异,CP/CPPS患者肠道中大肠埃希菌属(Escherichia)的相对丰度显著升高。菌群结构改变进一步通过影响不同的代谢通路,影响疾病的进展。利用菌群构建的疾病诊断模型能将患者区分为不同的类型,为临床精准分型,指导个体化临床诊治提供了理论基础。结论:本研究采用全外显子组关联分析和肠道菌群宏基因组分析,发现了一批与CP/CPPS相关的遗传变异,找到了与疾病相关肠道菌群变异,为进一步研究宿主遗传和肠道微生物对CP/CPPS的发生发展的影响提供了证据支持。