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【目的】肝细胞肝癌(hepatpcellular carcinoma,HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均较高,是严重威胁人类健康的恶性疾病。研究表明HCC的发生发展与多种危险因素相关,而其中重要的病因是慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染。临床资料表明,全球大约54%的HCC可以归因于HBV感染,并且HBV阳性的HCC与HBV阴性的HCC在发病机理和疾病转归方面有明显的不同,但是其具体的分子机制仍不清楚。目前,大量的研究揭示了长链非编码RNA(lnc RNA)能够广泛参与到人类癌症的进展过程中,包括HCC。为了探究lnc RNA与HBV相关的HCC发生发展的关系,我们前期采用深度测序的方法分析了HBV阴性与阳性的HCC组织中异常表达的lnc RNA,从中筛选了一个明显高表达的lnc RNA分子n335586。本研究拟解析n335586在HCC细胞中异常表达的具体调控机制,并探究其对肝癌细胞恶性行为的影响极其作用机制,从而阐明n335586在肝癌发生发展中的作用,以期为肝癌的诊断治疗提供新的分子基础与理论依据。【方法】首先,运用RT-q PCR方法检测了HBV阴性和HBV阳性的肝癌组织以及肝癌细胞系中n335586的表达情况。接着在Hep G2细胞中瞬时转染HBV1.3过表达质粒及HBV各编码蛋白的质粒,通过RT-q PCR技术进一步检测n335586的表达。然后应用平板克隆形成实验、MTT实验、Transwell迁移和侵袭实验、Western Blot实验检测了n335586对肝癌恶性行为及EMT进程的影响。为了解析n335586的具体作用机制,我们首先通过RT-q PCR和Western Blot实验检测了n335586对其宿主基因CKMT1A表达的影响,然后利用细胞功能学实验及Western Blot实验验证了CKMT1A对肝癌细胞恶性行为及EMT过程的作用。接着通过生物学信息方法预测了具有n335586及CKMTA的共同潜在结合位点的候选mi RNA,并应用RT-q PCR、EGFP荧光报告载体实验及Western Blot实验证实了mi R-924能够竞争性结合n335586与CKMT1A。随后,进一步运用RT-q PCR、EGFP荧光报告载体实验及Western Blot实验检测了n335586对CKMT1A的调控作用是否依赖mi R-924,并通过mi R-924介导实现的。最后应用Western Blot及细胞功能学的挽救实验证mi R-924是否介导了n335586对肝癌细胞的功能学作用。【结果】RT-q PCR实验结果表明与HBV阴性组织相比,n335586在HBV阳性的HCC组织中表达上调。此外,HBV阳性细胞系Hep G2.2.15细胞中n335586的表达水平明显高于其在HBV阴性细胞系Hep G2中的水平;同时在Huh7细胞中转染HBV复制型质粒p HBV1.3后n335586的水平明显高于对照组。这些数据都进一步证实了我们深度测序的结果。当在Hep G2和Huh7细胞中转染HBx过表达质粒后,n335586表达水平升高,这表明是HBV本身编码的X蛋白诱导了n335586的表达升高。细胞功能学实验表明n335586能够促进肝癌细胞的迁移、侵袭能力以及EMT进程,从而发挥促癌基因的作用。RT-q PCR和Western Blot实验表明n335586能够调控并促进其宿主基因CKMT1A的表达,并且细胞生物学功能实验表明CKMT1A同样能够促进肝癌细胞的迁移侵袭以及EMT。生物信息学预测发现mi R-924具有n335586与CKMT1A的共同潜在结合位点,EGFP荧光报告载体实验及RT-q PCR证实mi R-924能够竞争性结合n335586与CKMT1A。并且我们应用RT-q PCR、EGFP荧光报告载体实验及Western Blot实验进一步证实,n335586能够以mi R-924依赖的方式正向调控CKMT1A的m RNA和蛋白水平。最后运用挽救实验证明mi R-924介导了n335586在肝癌细胞中的生物学功能。【结论】本研究发现n335586在HBV阳性的肝癌组织中异常高表达,并受HBx蛋白的调控。细胞功能学实验表明n335586通过与CKMT1A共同竞争性结合mi R-924,作为竞争性内源RNA(ce RNA)发挥其促癌作用。