牛病毒性腹泻(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一种主要感染反刍动物的传染性疾病,BVDV为黄病毒科瘟病毒属成员,该病能够引起牛的腹泻、繁殖力下降、产奶量下降、胎儿生长缓慢、呼吸道症状、犊牛持续感染,还会引起流产、胎儿畸形、木乃伊胎、死胎等繁殖障碍。持续性感染牛将终生保持病毒血症的状态且持续对外排毒,该病呈世界性流行,给养牛业带来严重的经济损失。牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV,又称作BHV-1)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病,IBRV属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、水痘病毒属成员,IBR主要表现为鼻气管炎症、呼吸困难、流鼻涕等症状,可引起脓疱性外阴阴道炎、龟头炎、结膜炎、犊牛脑膜脑炎、乳房炎、奶牛流产等,直接引起的死亡率不高,但影响牛的生长、产奶量以及国际贸易,严重影响养牛业的健康发展。BVDV与BHV-1两种病毒均能引起免疫抑制,使感染机体容易继发其它病原感染,造成较为严重的临床症状;这两种病毒与牛的运输热密切相关,是造成牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的两个主要病原,是养牛业密切关注的疫病。伪狂犬病(PR)也称为Aujeszky病(AD),是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的,PRV是一种线性双链DNA病毒,与BHV-1一样同属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科和水痘病毒属的成员,PRV可感染反刍动物、食肉动物、啮齿动物,对牛的感染也有相关报道,感染牛死亡率高,对养牛业具有一定的威胁。本研究自2017年~2019年三年间持续跟踪山东省规模化牛场上述病毒病的流行动态,从山东省不同地区规模化牛场采集血液样品并搜集临床病例,通过血清学、病原学和病理学方法开展BVD、IBR与PR的流行病学调查研究,调查分析了BVD与IBR两病的共感染状态,详细观察了临床病例的病变特征,对从山东省牛群中分离鉴定的PRV、BVDV与BHV-1毒株的分子生物学特征和遗传进化进行了分析。2017年从山东省10个地区10个场共计采集333份血清样品,2018年从山东省11个地区11个场共计采集451份血清样品,2019年从山东省16个地区22个场共计采集514份血清样品,开展血清学流行病学调查,研究结果显示,2017年~2019年三年间BVD、IBR两种疫病在山东省的阳性率居高不下,一直保持极高的感染率,山东省牛场这三年两种疫病个体血清学阳性率高的在90%以上,甚至高达100%,但另一方面也有阳性率为0的阴性场;2017~2019年BHV-1三年的平均个体阳性率分别为44.20%、48.56%、61.67%,BHV-1三年的场阳性率分别为100%、100%、77.27%;BVDV三年的平均个体阳性率分别为61.60%、59.42%、61.33%,BVDV三年的场阳性率分别为80%、100%、95.45%,表明山东省两种疫病流行状况比较严重。另外,值得注意的是两种疫病的共感染阳性率比较高,三年的平均共感染个体阳性率分别为37.10%、35.92%、46.33%,由于所调查的牛场均是两病未免疫场,因此,血清学阳性率反映了牛群个体正在感染或者曾经感染过这两种病毒的情况。两病毒共感染率高,这就提示我们除了关注单一病原的致病性外,也要关注两病毒共感染的致病作用及其机制。通过病原学流行病学调查,共分离到5株BVDV毒株,均为NCP型,分别为1b、1d、1f、1m、1n亚型;分离到1株BHV-1毒株,为BHV-1.2亚型。为了调查牛群中PR的感染情况,我们随机抽检了9个牛场的246份血清样品的PRV gE抗体,未发现有阳性牛,即没有发现牛感染PRV后存活的牛只。在流行病学调查的过程中,发现了一起PRV自然感染牛的病例,受感染的9头牛只均发生死亡,其余未感染牛紧急淘汰处理,该病例使我们深刻体会到PRV给养牛业带来的风险。我们对该病例的病死牛进行了病理剖检并采集了大脑、肝脏、心脏等组织病料,进行了组织病理学观察和病毒的分离鉴定等研究。病死牛剖检只见脑膜明显充血,其它组织器官未见明显的眼观病变。病理组织学观察发现病死牛的大脑有典型的病毒性脑炎病变,并从脑组织中分离到一株PRV毒株(SDLY-China-2018)。对分离到的PRV毒株开展了遗传进化分析、毒力和致病性研究,最终证实分离到的PRV病毒株与2012年以来在我国猪场暴发的PRV变异株有较近的亲缘关系,也有着较强的毒力和致病性。在没有PRV变异株出现之前中国养牛业在相当长的一段时间内处于PR稳定状态,因此提示我们PRV发生变异后不但对猪的致病性增强,对猪以外的动物甚至人的健康构成威胁。鉴于BVD和IBR两病存在较高的共感染阳性率,BVDV能够形成持续性感染,BHV-1能够形成潜伏感染,并且这两种病毒均能够导致感染机体的免疫抑制。为了研究这两种病毒是否有协同致病作用及共感染发病机制,我们开展了BVDV和BHV-1体外共感染实验。通过两病毒单独感染和共感染MDBK细胞和BT细胞,发现两病毒在MDBK细胞和BT细胞上,共感染相较于单独感染均抑制了两种病毒的复制;另外BVDV和BHV-1共感染与BVDV单独感染时相比LC3-Ⅱ表达量降低,即共感染相较BVDV单独感染而言,自噬水平降低。通过流式细胞术分析发现,共感染升高了BVDV所致的细胞凋亡水平,却降低了BHV-1所致的细胞凋亡水平。由于BVDV能够诱导自噬,并且当自噬增强时病毒复制也增强,当两病毒共感染时BVDV诱导的MDBK细胞自噬水平降低,这可能是共感染时BVDV增殖受到抑制的原因之一。BHV-1能够诱导MDBK细胞发生凋亡而使细胞迅速死亡,从而使子代病毒快速释放进而感染更多的细胞,从而促进BHV-1的增殖,由于共感染降低了MDBK细胞的凋亡水平,从而使BHV-1子代病毒释放受阻,因此这可能是共感染导致BHV-1增殖减弱的原因之一。此外,为了研究两病毒共感染和单独感染与先天性免疫反应的关系,我们利用qPCR技术分别检测了两病毒共感染和单独感染时,MDBK细胞中干扰素相关基因(IFN、Mx1、ISG-15)mRNA水平的变化。研究结果表明,两种病毒共感染相比于单独感染时,诱导的天然免疫反应增强,这可能也是共感染相较于单独感染两种病毒增殖减弱的原因之一。