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目的上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)病变隐匿不易早期发现且病情发展迅速,居女性生殖道恶性肿瘤死因的首位。远处转移和化疗耐药是其主要生物学特征。抗失巢凋亡是卵巢癌转移和化疗耐药的重要机制之一。卵巢癌中Trk B/BDNF通过激活下游的PI3K/AKT细胞存活通路发挥抗失巢凋亡作用。针对卵巢癌细胞抗失巢凋亡的研究已有数年,最近micro RNAs在卵巢癌中的研究成为热点。经过筛选EOC组织中异常表达的micro RNAs,发现位于9号染色体上的mi R-204基因表达缺失,mi R-204在胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌中作为抑癌因子,可抑制其侵袭和转移。生物信息学软件预测BDNF为mi R-204的靶基因之一。目前尚且缺乏mi R-204在EOC失巢凋亡中作用的研究。本研究目的在于:①探究mi R-204在EOC抗失巢凋亡中的作用;②探求mi R-204在上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡中可能的作用机制。方法1选用SKOV-3、HO-8910细胞株,贴壁培养模拟卵巢癌原发灶细胞的生长状态,称为贴壁培养组,建立失巢凋亡模型筛选出具有失巢凋亡抗性的细胞以模拟卵巢癌转移灶细胞的生长状态,称为失巢凋亡组;荧光定量PCR检测SKOV-3、HO-8910细胞在贴壁生长和悬浮生长状态下mi R-204表达水平;2选择第一部分实验筛选出的具有抗失巢凋亡表型的HO-8910细胞,转染指示剂检测HO-8910细胞转染效率,构建pre-mi R-204质粒,转染HO-8910细胞。荧光定量PCR检测mi R-204表达;3建立失巢凋亡模型,流式细胞术检测细胞凋亡率;4应用体外侵袭模型,检测细胞的侵袭能力;5应用划痕实验检测细胞迁移能力;6应用荧光定量PCR法,检测细胞BDNF m RNA表达水平;7 Western blotting检测p AKT和总AKT蛋白表达水平。结果1失巢凋亡模型组中细胞呈悬浮状态、团簇状生长,模型构建成功;失巢凋亡模型组较贴壁培养组mi R-204含量显著降低,SKOV-3细胞在贴壁培养组和失巢凋亡组中的数值分别为1±0.0082和0.7283±0.0082,HO-8910细胞在两组中的数值分别为0.6242±0.0024和0.2577±0.0112,差异有统计学意义(P<0.05);2检测HO-8910细胞转染效率为90%,测序报告显示重组质粒构建成功,转染后mi R-204质粒组mi R-204含量为10.1±0.016,较其余3个对照组增高(P<0.05);空白对照组、转染试剂组、mi R-204 NC组中的mi R-204 m RNA含量依次为1±0.0039、1.07±0.014、0.929±0.011,差异均无统计学意义(P>0.05);3失巢凋亡模型中细胞呈团簇状悬浮生长;流式细胞分析术结果显示mi R-204质粒组凋亡率为73.22±0.70,较其余3个对照组凋亡率增加(P<0.05);阴性对照组、转染试剂组、mi R-204NC组中细胞凋亡率依次为48.98±0.55、45.16±0.49、54.46±0.62,差异均无统计学意义(P>0.05);4建立细胞体外侵袭模型,结果显示mi R-204质粒组中透膜细胞数为86±4.5789,较其余3个对照组减少(P<0.05);阴性对照组、转染试剂组、mi R-204NC组中透膜细胞数依次为153±15.4973、150±14.1480、140±6.0800,(P>0.05);mi R-204质粒组卵巢癌细胞侵袭能力降低,差异有统计学意义。5划痕实验结果显示mi R-204质粒组中24h迁移距离为7.3±0.126,较其余3个对照组减少(P<0.05);空白对照组、转染试剂组、mi R-204 NC组细胞迁移距离依次为11.2±0.276、12.5±0.228、10.4±0.335差异均无统计学意义(P>0.05)。mi R-204质粒组中48h迁移距离为10.5±0.252,较其余3个对照组减少(P<0.05);3个对照组细胞迁移距离依次为20.3±0.289、19.2±0.288、20.6±0276差异均无统计学意义(P>0.05);mi R-204质粒组卵巢癌细胞迁移能力下降。6荧光定量PCR检测BDNF m RNA表达水平,结果显示mi R-204质粒组BDNF m RNA为0.22±0.0098,较其余3个对照组降低(P<0.05);阴性对照组、转染试剂组、mi R-204NC组BDNF m RNA依次为1±0.0060、1.06±0.0139、0.96±0.0098,差异均无统计学意义(P>0.05);mi R-204质粒组卵巢癌细胞BDNF m RNA水平降低,差异有统计学意义。7取p AKT/总AKT值表示AKT磷酸化水平。结果显示mi R-204质粒组中p AKT/总AKT值为0.068±0.028,较其余3个对照组降低(P<0.05);空白对照组、转染试剂组、mi R-204 NC组p AKT/总AKT值依次为0.159±0.046、0.175±0.037、0.164±0.051,差异均无统计学意义(P>0.05);mi R-204质粒组卵巢癌细胞p AKT磷酸化水平降低。结论1 mi R-204介导了上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡;2 mi R-204可能通过Trk B/BDNF-PI3K/AKT通路介导上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡。