癌症已经成为威胁人类健康的一大重要疾病,全世界每年都有很多人死于癌症,目前通常采用化疗、放疗、手术切除等方法进行癌症的治疗。但是癌症的治疗一般都很困难,并且预后不佳。探索如何最大限度杀伤癌细胞和最大限度保护正常细胞,成为了医学研究者近些年来努力探索的方向之一。血色素氧化酶-1(HO-1)是哺乳动物细胞中广泛存在的一种可诱导酶,具有抗氧化,抗凋亡等效应,是细胞内重要的保护酶类,并与肿瘤的发生发展有很大关系。有研究发现干预肿瘤细胞内HO-1表达可以影响肿瘤的生长,并且可影响肿瘤细胞对化学疗法的敏感性,为肿瘤的化疗提供辅助作用；当肿瘤治疗到恢复阶段,放化疗产生的氧化自由基会继续杀伤机体的正常细胞,增加HO-1的表达及其活性则可以起到保护正常细胞的作用。前期的研究中构建HO-1的真核表达载体,但该表达载体并不能人为地有效调控目的基因的表达。本实验采用Tet-Off调控表达系统载体,构建一个能够人为调控目的基因HO-1表达的真核表达载体pBI-EGFP-hHO-1,为后续实验奠定基础。　　 目的:构建Tet-off调控的HO-1真核表达载体pBI-EGFP-hHO-1并检测其在肝癌细胞中表达。　　 方法：①用PCR的方法从质粒pCDNA3.1(+)-hHO-1扩增目的基因hHO-1,用NhcI和MluI分别双酶切质粒pBI-EGFP及PCR扩增的HO-1,用T4连接酶连接,构成重组质粒；②鉴定HO-1基因插入成功后,将Tet-Off质粒和重组质粒共转染人肝癌SMMC-7721细胞,48h后用RT-PCR、SDS-PAGE和免疫细胞化学的方法检测其在细胞内的表达情况；③用RT-PCR的方法检测共转染48h后不同浓度盐酸多西环素对HO-1mRNA表达量的影响,确定该四环素调控系统的盐酸多西环素诱导量。　　 结果：重组质粒的鉴定:用NheI和MluI双酶切鉴定表明hHO-1成功克隆入表达载体pBI-EGFP中。　　 hHO-1基因在肝癌细胞表达的鉴定:①hHO-1基因转染入细胞内48h,提取细胞总RNA,经RT-PCR检测显示转染Tet-Off质粒和重组质粒pBI-EGFP-hHO-1组HO-1mRNA表达显著升高；②hHO-1基因转染入细胞内48h,提取细胞总蛋白质,经SDS-PAGE检测显示在32KD出有明显蛋白质表达且转染Tet-Off质粒和重组质粒pBI-EGFP-hHO-1组HO-1蛋白质表达高于对照组；⑨hHO-1基因转染入细胞内48h,经免疫细胞化学检测显示转染Tet-Off质粒和重组质粒pBI-EGFP-hHO-1组细胞棕红色染色明显深于对照组。　　 Tet-off调控的HO-1真核表达载体pBI-EGFP-hHO-1的盐酸多西环素诱导剂量的确定:hHO-1基因转染入细胞内48h,经RT-PCR检测显示当盐酸多西环素浓度大于等于2000ng/ml时,HO-1mRNA表达降低至和未转染组接近。　　 结论：本实验成功构建了能够在肝癌细胞内大量表达HO-1基因的Tet-off调控的HO-1真核表达载体pBI-EGFP-hHO-1,并确定盐酸多西环素诱导剂量为2000ng/ml。