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桑枝(Ramulus Mori)为桑科植物桑Morus alba L.的嫩枝，为一种常用中药。主要用于治疗手足麻木、风湿痹痛、瘫痪和肩臂关节肿痛等症。桑枝中主要含有黄酮和生物碱，还有茋类、萜类、香豆素等多种化学成分。本实验将桑枝用85%乙醇加热回流提取，提取物经大孔吸附树脂吸附，乙醇解吸后再经柱层析(硅胶，ODS，凝胶)等分离手段，最终得到7个单体化合物。利用NMR、MS等波谱学手段并结合理化性质，鉴定了这7个化合物的化学结构，它们分别为：3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3,4,5-trimethoxyphenyl-1-O-β-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside)(T-1)、桑皮苷A(mulberroside A)(T-2)、顺式-桑皮苷A(cis-mulberroside A)(T-3)、香豆素-7-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(coumarin-7-O-α-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside)(T-4)，氧化白藜芦醇-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(oxyresveratrol-2-O-β-D-glucopyranoside)(T-5)，β-谷甾醇(β-sitosterol)(T-6)，β-胡萝卜苷(β-daucosterol)(T-7)。其中化合物T-1，T-3和T-4首次从桑枝中分得。本实验还建立了3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(T-1)和顺式-桑皮苷A (T-3)的HPLC含量测定方法。一、化学成分的提取、分离和结构鉴定1.提取取干燥的桑枝20Kg，粉碎，用85%的乙醇回流提取3次(液料比分别为8:1、8:1、6:1，V/W)，每次2h，过滤，合并提取液，浓缩后用水稀释，过AB-8大孔吸附树脂柱，用85%乙醇洗脱，浓缩干燥得提取物300g。2.分离与纯化将上述300g提取物以洗脱液5作为流动相进行硅胶柱层析，得到A1~A8八个部分。1)将A3部分反复进行硅胶、ODS和凝胶柱层析得到化合物T-5、T-6和T-7。2)将A5部分进行硅胶柱层析，得到A5-1~A5-7七个部分。从A5-6部分得到化合物T-1和化合物T-4。将A5~7部分经反复硅胶、ODS和凝胶柱层析，得到化合物T-2和化合物T-3。3.结构鉴定通过UV、IR、MS、NMR等波谱学手段，结合理化性质并与文献对照，确定化合物T-1为3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物T-2为桑皮苷A；化合物T-3为顺式-桑皮苷A；化合物T-4为香豆素-7-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物T-5为氧化白藜芦醇-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；化合物T-6为β-谷甾醇；化合物T-7为β-胡萝卜苷。二、HPLC法测定桑枝中两种化学成分的含量建立了从桑枝中首次分离得到的两种化合物3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷（T-1）和顺式-桑皮苷A(T-3)的HPLC含量测定方法。1.仪器及色谱条件：Agilent1200型高效液相色谱仪，UV检测器。色谱柱：Cosmosil C18-MS-II (4.6×250mm ODS,5μm)，柱温：25℃；流动相：甲醇-水（22:78）；流速：1.0mL.min-1；检测波长：210nm；进样量：20μL。2.系统适应性及方法学考察I理论塔板数和分离度在本实验条件下，T-1的理论塔板数为10254，分离度为2.60；T-3的理论塔板数为10144，分离度为8.44，符合2010版中国药典对高效液相色谱法的要求。II检测限和定量限本实验条件下，T-1的检测限为0.1ng，定量限为1.5ng；T-3的检测限为1.0ng，定量限为2.0ng。III精密度实验日内精密度考察结果：T-1的峰面积的RSD(n=6)值为1.01%，保留时间的RSD(n=6)值为0.72%；T-3的峰面积RSD(n=6)值为1.05%，保留时间的RSD(n=6)值为0.74%，可见方法的日内精密度良好。日间精密度考察结果：T-1的峰面积的RSD(n=6)值为1.90%，保留时间的RSD(n=6)值为0.80%；T-3的峰面积RSD(n=6)值为1.77%，保留时间的RSD(n=6)值为1.49%，可见方法的日间精密度良好。IV线性关系在0.02~5.0μg范围内，T-1和T-3的峰面积(Y)与进样量(X, μg)呈现良好的线性关系。方程分别为：化合物T-1： Y=2299.5x+17.924，r=0.99999化合物T-3： Y=2604.5x-10.581，r=0.99998V重复性实验测定同一个样品的6份供试品溶液的峰面积，计算T-1和T-3含量的RSD(n=6)值分别为0.88%和1.37%，可见方法重复性良好。VI稳定性实验测定同一份供试品溶液在2h、4h、6h、8h、10h和12h的峰面积，计算T-1的峰面积的RSD(n=6)值为1.27%，保留时间的RSD(n=6)值为1.18%；T-3的峰面积的RSD(n=6)值为0.27%，保留时间的RSD(n=6)值为0.35%，可见供试品溶液中T-1和T-3在12h内稳定。VII加样回收率实验T-1的平均回收率为99.63%，其RSD(n=6)值为1.18%；T-3的平均回收率为100.12%，其RSD(n=6)值为0.81%，可见该方法回收率良好。VIII桑枝样品的含量测定四个批次桑枝中化合物T-1的平均含量为0.030%,化合物T-3的平均含量为0.011%。本实验深入研究了桑枝中的化学成分，并建立了桑枝中3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和顺式-桑皮苷A的HPLC含量测定方法。本实验的研究结果为桑枝药材质量标准的完善提供了新的含测指标，也为桑枝的开发利用提供了新的科学依据。