论文部分内容阅读
汞是全球性污染的高毒性元素之一，在环境和生物体中可以长期积累并不可降解。无机汞可以造成人类精神障碍等疾病，烷基化的汞也具有特殊的神经毒性，甲基汞对成人大脑具有极大的伤害，汞还可以通过影响激素代谢从而导致高血压。目前，汞的检测方法主要还是依靠传统的检测仪器，包括冷原子吸收光谱分析法（CV-AAS）与电感耦合等离子发射光谱分析（ICP-AES）等，这些方法具有费用高、处理量有限、检测时间长等缺陷，而免疫检测的方法检测快速、费用低廉、灵敏度高和选择性强等优点，近年来受到国内外广泛的关注。
分别制备免疫原Hg-ITCBE-KLH与包被抗原Hg-ITCBE-BSA及ITCBE-BSA，经过超滤纯化后，三硝基苯磺酸法（TNBS）测三种抗原中ε-NH2被半抗原替换的程度依次为34．75±4．60％、40．61±0．99％、61．27±0．69％，冷原子吸收光谱分析法检测抗原中汞离子的含量依次为38．4±0．5μg/mL、125．5±0．9μg/mL、0μg/mL，各种抗原与载体蛋白的紫外吸收光谱的特征均不相同，SDS-PAGE结果显示免疫原与包被抗原的分子量均高于各自的载体蛋白。
以Hg-ITCBE-KLH免疫BALB/C小鼠，采用间接ELISA检测效价，三次免疫后，取免疫后小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，用Hg-ITCBE-BSA与ITCBE-BSA做包被抗原，筛选融合后能正常生长的细胞株，利用有限稀释法进行2次阳性克隆。获得一株稳定分泌抗汞螯合物杂交瘤细胞株3C9G12。其腹水效价达到5×10-3，亲和常数5．63×109L/moL，单抗亚类为IgM、K型，分子量约为900kDa。特异性实验表明，与其他金属离子（pb2+，Cd2+，Cu2+，Fe2+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，Mg2+，K+，Na+）均无明显较差反应，具有较高的特异性。本研究成功制备了高亲和力和高特异性的单克隆抗体，为环境和农产品中残留汞的快速免疫检测奠定了基础。
利用mAb3C9G12与Hg-ITCBE-BSA构建并优化间接竞争ELISA，Hg-ITCBE-BSA最佳工作浓度为4 μg/mL，mAb3C9G12的最佳浓度为80ng/mL，EDTA的使用浓度为20mM，最适合pH为6，检测下限为0．8 μg/L，IC50为31．19μg/L，其他金属螯合物的交叉反应均低于2％，同一批次与不同批次之间分析变异系数分别是2．73-4．60％，3．24％-7．23％，超纯水、自来水、湖水、小青菜、小麦粉样品中汞添加回收率为91．0-109．8％。