肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化道常见的恶性肿瘤,世界范围内其发病率及死亡率均居所有恶性肿瘤第三位[1]。现有的手术切除以及放、化疗等方法治疗肠癌的效果有限,治疗后仍有50%的肠癌病人会出现复发性肿瘤及转移,且伴有分级和分期增加,生存质量受到严重损害。因此,开发新的治疗途径,研究新的抗癌药物,安全有效地治疗肠癌并且预防肠癌复发、转移具有很大的迫切性。肠癌的发病机制十分复杂,细胞周期调控异常是其重要机制之一。p21基因是我们熟知的抑癌基因,其表达的P21蛋白是细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制剂(CDKI)家族中重要的调节因子,P21表达水平升高时能抑制CDK的活性,从而阻滞细胞周期的进展,抑制细胞增殖[2]。众多学者相关报道表明,p21表达减低或缺失是肠癌发生、发展中的一个普遍事件。研究显示,激活p21基因可诱导肠癌细胞产生周期阻滞、导致肿瘤细胞凋亡及衰老[3]。值得关注的是,最新研究发现p21与肿瘤干细胞调节相关[4],而越来越多的研究证实肿瘤干细胞是肠癌发生、发展、转移、复发、抵抗放、化疗作用的根源[5],因此,p21基因是治疗肠癌的重要靶点。为此,研究者展开了大量以p21为靶点的抗肠癌药物的发现及其分子机制研究工作[6]。但是p21是p53基因调节通路的下游基因,其表达受p53基因水平影响,而p53突变在肠癌中普遍发生,因此采用药物激活细胞p21表达的肠癌治疗策略面临巨大挑战[7],寻找一种可以直接、高效激活肠癌细胞p21表达的方法尤为重要。2006年李龙承教授报道了小激活RNA(saRNA)及其引起的基因激活现象[8]。与以往小RNA调控机制不同,saRNA是以目标基因启动子序列为靶点,引起基因表观遗传学改变,直接激活目的基因表达[9]。众多体外及在体研究表明,具有特殊序列的小激活RNA:dsRNA-p21可安全、高效地激活肿瘤细胞p21基因的表达、抑制肿瘤生长[10]。因此,dsRNA-p21是具有潜力的肠癌基因治疗分子候选物。文献调研未见dsRNA-p21治疗肠癌的相关研究报导,因此我们课题的第一部分工作为考察dsRNA-p21分子的抗肠癌效应。第一部分研究内容:具有特殊序列小激活RNA(dsRNA-p21)的抗肠癌研究。目的:探讨dsRNA-p21用于肠癌治疗的可行性及其机制。方法:选择三种肠癌细胞系:HCT-116,HT-29,HCT-116p53(-/-),分别转染 dsRNA-p21,考察转染后肠癌细胞p21基因的表达及其引起的生物学效应。建立人肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,通过瘤内注射考察dsRNA-p21体内抑癌活性。结果:1、dsRNA-p21转染三种人肠癌细胞株后均能显著上调细胞p21基因mRNA和蛋白的表达,其激活效率与细胞固有p21及p53表达水平无关,激活途径不依赖p53的完整性;2、转染dsRNA-p21后,三种人肠癌细胞的增殖活性明显受到抑制,细胞周期阻滞,细胞凋亡增加,克隆生成能力降低,细胞迁移能力下降;3、瘤内注射dsRNA-p21可抑制荷瘤鼠皮下瘤生长,诱导体内肿瘤细胞凋亡和P21蛋白表达。结论:dsRNA-p21可直接激活肠癌细胞p21表达,并具有良好的体外和体内抗肠癌效应。RNA激活技术可能成为一种新型肠癌基因治疗方法。长期以来,递送系统是小RNA治疗成功的瓶颈与关键,其发展严重阻碍了核酸治疗技术的进步及临床转化。在小RNA治疗肿瘤的研究中,普遍希望采用系统给药。然而,系统给予小RNA治疗肠癌面临的最大挑战是难以实现有效治疗量的药物在靶部位蓄积[11];系统给予核酸药物还存在激发机体免疫应答的潜在威胁[12]。替代的方案是小核酸原位给药,该方案可以将药物直接递送至作用部位,保证有效药物剂量到达靶组织,规避系统给药屏障并且克服生物药物免疫应答及其他不利影响。值得一提的是,kang等人采用膀胱原位灌注的方式递送dsRNA-p21治疗膀胱癌,在裸鼠原位膀胱癌模型上取得成功[13]。结合肠癌的生理、病理特点[14],我们认为,原位施与dsRNA-p21治疗肠癌具有实现药物临床转化的可行性。小RNA稳定性差,易被核酸酶降解,且带负电性、亲水性强,不易通过细胞膜脂质双分子层,需借助载体的递送和保护才能进入细胞发挥作用。由此,在课题的第二部分我们开展了 dsRNA-p21原位递送系统研究工作。第二部分研究内容:dsRNA-p21递送系统研究。研究目的:构建安全、合理、有效的递释系统,进行原位递送dsRNA-p21抗肠癌研究。研究方法:构建二硫键交联的嵌合型PEI衍生物:PEI-SS,并制备两相复合物,在此基础上以生物相容性好,且具有肿瘤靶向性及生物粘附性的透明质酸(HA)为被膜,制备dsRNA-p21超分子组装体。对此载药系统的理化性质、细胞毒性、细胞摄取效率、胞内行为、肿瘤靶向性及摄取机制进行考察,并进行载药系统体外药效学研究和体内药物分布研究。结果:构建的PEI-SS具有良好的缔合dsRNA-p21分子能力,在pH值为7.4到5的范围内具有足够的质子缓冲能力,能与dsRNA-p21结合形成直径在150 rnm左右的球形粒子,在模拟细胞内还原条件下,可实现组装体的解组装响应。在此基础上制备的dsRNA-p21超分子组装体生物相容性好,对肿瘤细胞靶向性和转染效率高。体外药效学研究结果表明研制的dsRNA-p21超分子组装体可高效激活肿瘤细胞p21表达,体内分布实验证实,经原位给药后药物可长时间停留于病灶部位,并富集于肿瘤细胞。结论:dsRNA-p21超分子组装体适用于原位给药治疗肠癌。对于肠癌的发生、发展及治疗,国内外学者作了大量的基础与临床研究。目前一些原位肠癌侵袭性模型已经被建立和应用[15,16]。这些模型采取将肠癌细胞悬液注射到盲肠,或缝合瘤块于结肠壁浆膜面来诱导肿瘤生长,组织块或癌细胞易于渗漏到或直接暴露于腹腔中使成瘤率低,制模不稳定,不能真实地模拟临床,人肠癌粘膜原位癌变,浸润转移的发生演变过程,影响实验结果。肠癌发病部位特殊的解剖学特征使发现、追踪瘤细胞,进而给予药物干预受到挑战。因此目前尚缺乏稳定的可用于药物筛选及评价的人肠癌原位动物模型。建立能模拟临床肠癌粘膜原位发生,并准确、简便、直观的追踪肿瘤的发展变化及转移的动物模型尤为重要且具有重要的临床价值。在课题的第三部分,我们开展了生物发光人肠癌原位动物模型的建立工作。第三部分研究内容:建立生物发光人肠癌原位BALB/c裸鼠模型。目的:建立生物发光人肠癌原位裸鼠模型,并对该模型的生物学特征进行评价。方法:将插入荧光素酶基因的慢病毒载体质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收获过表达荧光素酶的慢病毒颗粒,将其感染人肠癌HCT-116p53(-/-)细胞,获得稳定表达荧光素酶的人肠癌细胞株:HCT-116p53(-/-)-Luc。采用显微手术技术将HCT-116p53(-/-)-Luc细胞悬液注射于裸鼠乙状结肠肌层,构建稳定表达荧光素酶的人肠癌原位裸鼠模型。结果:建立的裸鼠模型成瘤率高、重复性强,能较好模拟临床肠癌粘膜原位发生、发展;荧光素酶表达稳定,可准确、简便、直观的追踪肿瘤的发展和转移。结论:建立的BALB/c裸鼠原位人肠癌模型适合用于研究肠癌发生发展、评价介入治疗效果、新药筛选等方面的实验研究。课题的最后一部分是利用所建立的动物模型,对构建的dsRNA-p21原位递送系统进行体内药效学和安全性评价。第四部分研究内容:dsRNA-P21原位递送系统体内药效学研究及安全性评价。目的:评价所构建的载dsRNA-p21原位给药系统体内抗肠癌效应及长期用药的安全性。方法:原位给予荷瘤鼠载dsRNA-p21超分子组装体,考察其抗肠癌疗效,同时进行长期用药的安全性评价。结果:原位给予载dsRNA-p21传递体系可显著抑制荷瘤鼠原位瘤生长,延长荷瘤鼠生存期,诱导瘤组织P21蛋白表达。长期原位给予此载药系统,对裸鼠肠粘膜无刺激性,对裸鼠各脏器无损伤。结论:所构建的dsRNA-p21原位给药系统治疗肠癌安全、有效。结论:本课题首次将saRNA介导的基因激活技术与新创的药物递送系统相结合,探索肠癌生物治疗的新策略。课题结合了分子生物学、药物化学、药剂学以及药理学的研究内容,首先证明具有特殊序列的小激活RNA:dsRNA-p21的抗肠癌效应;为了突破RNA治疗的递送瓶颈,通过载体构建和处方优化建立了dsRNA-p21的体内原位传递系统;最后采用生物发光原位肠癌裸鼠模型,证明了所构建载药系统治疗肠癌的安全性及有效性。本课题的顺利完成充分体现了学科交叉和学科互补的特点及优势,一方面可为肠癌的治疗提供有效的生物治疗方法,同时也为核酸递送治疗其它肿瘤提供借鉴。