孔雀石绿（malachite green,MG）,极易溶于乙醇等有机溶剂但不溶于水。常被水产养殖业用来预防和控制多种疾病如真菌病、寄生虫病、细菌性疾病等,或者用于水产品的长途运输或存放的保鲜,保证水产品的存活率。而孔雀石绿及其代谢产物（隐色孔雀石绿,LMG）能长期残留在动物组织肾脏、皮下脂肪、肌肉、肝和血液中,人类食用后,会通过蓄积中毒,导致人致癌等毒副作用,危害人的生命健康。但由于孔雀石绿价格低廉、且目前没有同等价格的替代药,并且防治效果好,使其在水产养殖、水产品运输及贮存过程中仍被广泛滥用。包括我国在内的多个国家己经将孔雀石绿列为禁用药物,但是因为其价格便宜,药效好,在市场上仍然违规使用。目前孔雀石绿的最终确证法为国家认可的液质联用方法,检测仪器价格高,检测费时长,操作人员需要进行专门培训,操作复杂。所以,建立一个准确、高灵敏度的孔雀石绿快速检测方法是迫在眉睫的。免疫学方法是目前常用的快速检测方法,价格便宜,敏感度高。抗体是免疫检测的核心,但孔雀石绿本身分子量很小,空间结构不复杂,不具有免疫原性,所以必须先制备具有免疫原性的完全抗原,然后通过免疫动物的方法制备抗体,采取竞争抑制的原理建立小分子物质免疫学检测的方法。1.孔雀石绿抗原制备及纳米抗体的筛选本文先通过化学方法设计合成羧基化的隐性孔雀石绿,将得到的羧基化孔雀石绿和载体蛋白BSA或OVA偶联到一起从而制得完全抗原。经核磁共振、紫外分析和SDS-PAGE电泳鉴定,发现成功制备孔雀石绿偶连蛋白MG-BSA（MG-OVA）,蛋白紫外吸收峰发生偏移,SDS-PAGE发现偶连产物蛋白略大于载体BSA（OVA）,证实得到具有免疫原性的孔雀石绿抗原。通过小鼠免疫实验,证明该抗原获得了良好的免疫效果,抗血清效价大于1:64000、血清抑制浓度小于10 ng/mL,为下一步纳米抗体的制备提供了抗原的保障。本文选择免疫库筛选孔雀石绿纳米抗体。先取健康羊驼作为免疫动物,免疫后,取20 mL外周血,通过淋巴细胞提取液提取淋巴细胞,提取总mRNA并鉴定纯度,以oligoDT12为引物,转录成cDNA,以转录的cDNA为模板,进行巢氏PCR扩增,获得编辑羊驼抗体VHH的基因片段,与噬菌粒载体体外重组,转化到表达系统,通过辅助噬菌体M13的救援,使得目的基因与外壳蛋白基因融合表达,从而使得目的蛋白展示在噬菌体表面,构建了免疫文库。通过体外筛选噬菌体文库,获得含有目的基因的单个噬菌粒,插入到表达细胞中,体外表达。最后采用HIS纯化的方法,得到抗孔雀石绿纳米抗体,通过SDS-PAGE电泳鉴定,大小为15 kd左右。2.孔雀石绿胶体金免疫层析检测试纸条的制备及鉴定本文采用胶体金免疫层析法制备孔雀石绿胶体金检测试纸条。采用柠檬酸三钠法制备还原氯化金溶液,得到40纳米左右的胶体金溶液。通过竞争抑制的原理,金标记纳米抗体,在NC膜的质控线（C线）处标记C抗体,在NC膜的检测线（T线）处包被孔雀石绿偶连抗原（MG-BSA）。当样品中无孔雀石绿时,金标记抗体在T线处,与偶连抗原（MG-BSA）形成抗原抗体复合物显色。当样品中含有孔雀石绿时,与偶连抗原竞争金标抗体,当含量足够高时,完全抑制偶连抗原与标记抗体结合,T线处不显色。T线的显色深度与孔雀石绿的含量成反比。通过正交实验,确定了最佳的抗原抗体比例,即抗体标记量为10 μg/mL、每孔金标抗体量为12 μL/孔、NC膜抗原量为0.5mg/mL,二抗浓度为0.4mg/mL。通过此配比研制的胶体金试纸条,取前处理得到的样品,上样后反应15分钟,根据C、T线色度对比,判定。检测试纸条检测15分钟,检测限0.5 ng/mL,判定速度快,灵敏度高,达到国家检测标准。满足了农业部、食品药品监督管理局的检测要求,为打击违法使用孔雀石绿提供了技术保障。3.孔雀石绿胶体金免疫层析检测试纸条的验证及其应用针对国家标准要求,对同一品种、同一规格的孔雀石绿快速检测试纸条,试制了3批不同批号产品。每批产品提供140份次,随机抽70份次进行产品检测。盲样制备中,孔雀石绿含量分别为临界值要求的0%,50%和100%的浓度水平,其中,0%和50%的浓度水平检测产品的假阳性率,100%的浓度水平考察产品的假阴性率。其中,0%和50%样本数各15份,定性值100%浓度水平的样本30份。实际样本的浓度残留含量与定性临界值的要求相当,不超过定性临界值要求的10%。通过样本的设置,在规定的检测时间内,做到检测试纸条满足国家检测部门的检测要求,来判定产品的灵敏度、稳定性是否满足基层检测的需要。在符合国家要求的条件下,将检测试纸条在江苏、浙江、江西等地第三方检测市场进行基层应用,共计检测12179份,样品涵盖市场养殖水样、各类水产品,包括草鱼、鲫鱼、昂刺鱼、鳜鱼、鲤鱼、甲鱼、黄鳝、泥鳅、河虾、罗氏沼虾、螃蟹、白贝、花甲等。其中,大部分检测结果为阴性,共检测出38份阳性样本,检测结果与国标对比,符合率98.1%。此产品的推广,节省了大量的人力、物力,同时能快速的检出结果,为保证农产品使用安全提供了有效的技术保障。