视网膜色素变性是一种遗传性致盲眼病，目前全世界范围内发病率为19-27/100，000，视网膜光感受器细胞进行性死亡是导致视力丧失的主要原因。光感受器细胞是终末分化的神经元，它们不能再生，一旦丧失就无法替代。因而关于视网膜光感受器细胞退变机制的研究非常重要。自1981年美国俄勒冈大学著名遗传学家George streisinger关于斑马鱼人工雌核发育的研究在《Nature》发表后，斑马鱼作为研究遗传发育的实验动物模型开始引起科学家的极大关注。目前斑马鱼已成为最受重视的脊椎动物发育生物学模型之一。斑马鱼的视网膜感光细胞以视锥细胞为主，在一些视网膜疾病的研究上具有独特优势，比如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等，选用斑马鱼作为模式动物极佳。Crumbs蛋白复合物是上皮极性的一个关键调节物。Crumbs蛋白复合物高度保守，这个复合物中主要的成员-Crumbs(Crb)最初在黑腹果蝇中被发现，对果蝇正常的光感受器细胞形态形成及粘着小带的形成和维持十分重要。在果蝇中只有一种Crb，在脊椎动物中有三种CRB-CRB1、CRB2和CRB3。CRB1基因突变与人类多种常染色体隐性遗传性视网膜变性相关，包括视网膜色素变性和Leber氏先天性黑蒙。目前对CRB1突变体尚未发现明确的基因型-表型之间的关联，说明Crumbs蛋白复合物的其它成分可能也影响疾病的严重程度。斑马鱼有5种Crb，它们分别是Crb1、Crb2a、Crb2b、Crb3a和Crb3b。在斑马鱼中，两个Crb2基因(Crb2a和Crb2b)与视网膜的发育和形态学缺陷相关。Crb2b主要在斑马鱼视网膜视锥细胞内节表达，Crb2b的细胞外区域介导细胞间粘附。Crb2b在维持光感受器细胞层完整性及稳定视锥细胞马赛克结构平面构建上发挥重要的作用。斑马鱼Crb2b功能与人类CRB1功能相似，研究Crb2b对斑马鱼光感受器细胞的影响有助于进一步揭示视网膜色素变性等退变性视网膜病变的发病机制。精确地计数视网膜细胞在时间和空间上的分布是研究视网膜发育及退变的基础。每个视网膜细胞只有一个细胞核，因此最直接计数视网膜细胞的方法是在光学显微镜下计数细胞核的数目。本论文首先结合JB-4塑胶树脂包埋和福尔根染色的方法观察斑马鱼视网膜细胞核。通过分析JB-4切片厚度、盐酸水解程度及Schiff反应条件对细胞核染色的影响，寻找一个最优地能够敏感且特异染色斑马鱼视网膜细胞核的方法。实验结果显示：盐酸浓度越高、浸润时间越长，染色程度越强；盐酸浓度越低、浸润时间越短，染色程度越弱。低浓度的盐酸可以通过延长浸润时间而提高染色强度。染色强度随着Schiff浸润时间的延长而增加，2小时达到最强染色。在2μm组织切片中单个细胞核比在3μm组织切片、4μm组织切片及6μm组织切片中显示出更清晰的核边界。在2μm厚经福尔根染色的JB-4切片中，视锥细胞中的常染色质区域能够清晰地和异染色质区域区分开。与亚甲天蓝II和核固红染色相比，福尔根染色特异性和稳定性更强。福尔根染色可以和标本包埋原位杂交技术相兼容。通过实验结果分析发现了一个最优地能够敏感且特异染色斑马鱼视网膜细胞核的方法。这个简单可靠的染色方法可以用于细胞计数及检测视锥细胞染色质整体结构，与标本包埋原位杂交技术相结合可同时观察细胞核和mRNA表达。本论文其次通过计数成年野生型斑马鱼视网膜神经节细胞、内核层细胞、水平细胞、视锥细胞及视杆细胞在视网膜不同区域内的细胞数目，通过比较不同年龄斑马鱼之间相同视网膜区域细胞数目的变化及某一特定年龄斑马鱼不同视网膜区域之间细胞数目的变化探讨野生型斑马鱼视网膜发育的特点。实验结果显示：野生型斑马鱼视网膜神经节细胞、内核层细胞、水平细胞、视杆细胞及视锥细胞在视网膜各个区域排列规整。斑马鱼早期视网膜各类细胞发育从周边部开始，逐渐向中央及两侧延伸，最终上形成特殊的空间分布特点：除视杆细胞外各类细胞视网膜中心区细胞数目最多，向两侧逐渐减少形成正态分布；视杆细胞视网膜前部-后部方向后部旁中心区细胞数目最多，向两侧逐渐减少；腹部-背部方向背部旁中心区细胞数目最多，向两侧逐渐减少形成偏正态分布。野生型斑马鱼视网膜细胞在时间上有一定的分布规律：伴随着斑马鱼的年龄增长，视网膜细胞总体呈现下降趋势，视杆细胞在斑马鱼生长早期局部区域呈现上升趋势。该实验结果为进一步揭示视网膜发育机制及研究退变性视网膜病变的发病机制提供必要的基础数据。另外，本实验结果显示斑马鱼随年龄增长光感受器细胞整体呈现下降趋势，晚期下降最为明显。人类年龄相关性黄斑变性是随年龄增长而进展的的光感受器细胞退变性疾病。通过本研究视网膜视锥细胞随年龄增长逐渐死亡，特别是到晚期视锥细胞大量死亡提供的基础数据可进一步揭示年龄相关性性黄斑变性的发病机制。本论文最后计数两个不同年龄阶段pt108b成年斑马鱼视网膜不同区域细胞的数目，观察pt108b斑马鱼视网膜细胞的空间分布；并通过与同年龄野生型斑马鱼相同视网膜区域细胞数目及视网膜细胞空间分布比较探讨Crb2b对视网膜光感受器细胞的影响。实验结果显示：pt108b转基因斑马鱼视网膜各类细胞在空间上并无像野生型斑马鱼一样规律的分布。pt108b转基因斑马鱼视网膜各类细胞分层破坏，细胞间排列松散，视锥细胞排列极其稀疏；特别是生长晚期细胞排列紊乱，个别区域视锥细胞完全丧失。pt108b转基因斑马鱼不同时期视网膜各个区域视锥细胞数目较同龄野生型斑马鱼均显著下降；且视网膜视锥细胞数目随年龄增长显著下降，至晚期视锥细胞数目急剧减少，个别区域视锥细胞几乎完全消失。但生长晚期除视锥细胞外其它细胞数目在视网膜局部区域呈现不同程度的增多，特别是视杆细胞在视网膜绝大多数区域均显著增多。实验结果说明Crb2b是维持成年斑马鱼视网膜各类细胞正常空间分布及视锥细胞存活的关键蛋白。Crb2b功能抑制可以导致成年斑马鱼视网膜视锥细胞死亡特别是生长晚期视锥细胞大量死亡以及神经节细胞、内核层细胞、水平细胞及视杆细胞在晚期视网膜局部区域不同程度的增生。pt108b转基因斑马鱼由于Crb2b功能抑制可以导致视网膜视锥细胞进行性死亡，逐渐进展的光感受器细胞死亡是遗传性视网膜色素变性显著的特征。该动物模型有助于进一步深入研究视网膜色素变性的发病机制。