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目的新生儿糖尿病(Neonatal DiabetesMellitus, NDM)是一种罕见的单基因遗传疾病,通常指出生后6个月内发生的糖尿病。也有少数出生6个月之后发生的糖尿病经基因检测后被确诊为单基因糖尿病。迄今为止,已确证的致病基因超过20种,以编码钾离子通道(ATP sensitive Potassium Channel, KATP)基因ABCC8、KCNJ11发生率最高。携带KATP突变患者大部分可从胰岛素注射成功转换为口服磺脲类药物治疗。明确基因诊断同时有助于患者家系进行遗传咨询。新生儿糖尿病的遗传基础具有高度异质性。目前,仍有部分患者病因未明。此外,不典型1型糖尿病患者临床表现和疾病进展迥异于典型患者,其背后的病因学机制也可能不同。尽管经典的Sanger测序技术至今仍是单基因疾病诊断领域的金标准,探索常规基因筛查阴性的新生儿糖尿病患者以及不典型1型糖尿病患者潜在的遗传基础,传统测序技术己不再适用。2009年第二代高通量测序技术(High-throughput sequencing technology)的引入使单基因疾病的研究进展迅速。本研究旨在结合传统测序与第二代测序技术(目标区域测序),进一步研究新生儿糖尿病和不典型1型糖尿病的分子遗传学基础,着重于未知致病基因的探索。对象和方法1.病例入组本中心共收集30例符合入组要求患者,经充分知情同意后,采集患者临床病史,包括出生体重、起病年龄、起病时症状、其他糖尿病综合征相关异常表现、实验室检查(空腹血糖、空腹胰岛素及C肽、糖化血红蛋白、1型糖尿病相关抗体等)和家族史；留取患者、患者同胞及父母外周血2-4ml。2.基因检测流程入组患者按起病年龄分为两组。一组：6个月以内起病患者,采用Sanger测序法对常见致病基因KCNJ11、INS和ABCC8进行筛查,筛查阴性患者进行目标区域外显子捕获及高通量测序。另一组：6个月以后起病患者,其中1岁以内起病患者常规筛查KCNJ11和INS基因,阴性患者和1岁以后起病患者一起进行高通量测序。其中,如患者表现为糖尿病综合征,采用Sanger测序法筛查相关致病基因,阴性患者进入高通量测序。3.数据分析高通量测序数据产出后,根据测序深度和覆盖度对测序质量进行评价。去除读取次数小于20次的低质量数据,余下的数据按照下面的标准进行功能性变异的筛检：1)变异位点位于功能区：编码区和剪切区；2)单碱基变异为无义突变、错义突变,或致剪切位点改变；插入/缺失变异导致移码突变、无义突变或剪切位点改变；3)突变位点MAF<0.01,或为非SNP位点。4.验证对筛选出的功能性变异设计引物,进行Sanger测序验证。验证阳性的突变位点,在家系内再次验证。符合孟德尔疾病遗传模式的变异位点,在表型正常的样本中进一步扩大验证。结果6例新生儿糖尿病患者常规筛查检出4例阳性患者,2例为KCNJ11突变,2例为INS突变；24例不典型1型糖尿病患者中,1例表现为Wolfram综合征,检出WFS1基因纯合突变。常规筛查阴性的2例新生儿糖尿病患者和22/23例不典型1型糖尿病患者进行目标区域测序,结果未发现可以致病突变。结论常规Sanger测序仍然是新生儿糖尿病基因诊断的首选方式。扩大范围的目标区域测序对病因未明的新生儿糖尿病患者是必要的。对不典型1型糖尿病患者进行常规基因筛查是有意义的,但现有临床筛选标准有待改进。扩大范围的目标区域测序对不典型1型糖尿病患者是否必要有待进一步探索研究。