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橡胶是海南最重要的特色经济作物,也是中国重要的战略性资源。然而我国并非是橡胶传统种植区,寒害是橡胶树的主要自然灾害之一。启动植物的低温反应机制,其中较为著名的是ICE-CBF信号通路。最近研究表明,拟南芥中ABA信号通路关键组份SnRK2.6蛋白激酶能够磷酸化并稳定ICE1蛋白,提高植物耐寒性能。但在橡胶树中,调控橡胶树ICE-CBF信号通路的关键因子至今未被研究,严重阻碍了利用分子生物学手段提高橡胶树冷耐受性的研究。因此对于调控橡胶树ICE-CBF信号通路的关键因子的功能研究,具有重要的理论意义和经济价值。本研究克隆了橡胶树SnRK2.6家族的基因,初步探讨了它们的生物学功能,为橡胶树耐寒品种的培育提供了一定的理论依据,主要研究结果如下:1、从巴西橡胶树叶片cDNA中克隆得到了HbSnRK2.6A、HbSnRK2.6B、HbSnRK2.6C、HbSnRK2.6D和HbSnRK2.6E五个基因,其开放阅读框大小分别为1092 bp,921 bp,1095bp,1089bp和1065 bp,与AtSnRK2.6基因进行了氨基酸序列比对及进化树分析,表明扩增得到的这些基因与其拟南芥中同族基因存在高度同源性。2、将HbSnRK2.6A-E的CDS构建到植物过表达载体PBWA(v)BS上,利用烟草瞬时表达系统及橡胶树原生质体转化实验对其进行亚细胞定位分析,结果均显示其主要定位于细胞核,细胞膜和细胞质中也有存在。3、将HbSnRK2.6A-E的CDS构建到酵母双杂诱饵载体pGBKT7上,并转化到酵母AH109菌株。结果显示其均有自激活活性,且自激活活性区域位于C端;酵母双杂实验结果表明,HbSnRK2.6家族内部成员不存在相互作用。4、利用RT-PCR分析HbSnRK2.6A-E在橡胶树叶片、茎、胶乳、根、树皮各组织的表达情况,结果表明:HbSnRK2.6A-E在以上不同组织中都有表达,且表达量在植物以上各组织中没有明显差异。5、通过农杆菌浸花法转化获得35S::HbSnRK2.6A和35S::HbSnRK2.6B转基因株系,并筛选获得35S::HHbSnRK2.6A和35S::HHbSnRK2.6B转基因纯合株系。表型分析结果表明,35S::HHbSnRK2.6A和35S::HbSnRK2.6B的根长和萌发率相对于野生型植株都表现出对ABA超敏感,暗示橡胶树中的HbSnRK2.6A和HbSnRK2.6B参与并正调控ABA信号通路,进一步证实我们所克隆的HbSnRK2.6是ABA信号通路的关键组成组份。6、对转基因植株35S::HHbSnRK2.K6A和35S::HHbSnRK2.6B进行低温胁迫处理,冷胁迫相关的生理指标测定结果表明:转基因植株35S::HHbSnRK2.6A 和35S::HHbSnRK2.6B脯氨酸含量高于野生型,而丙二醛含量、电导率和H2O2的积累都低于野生型;这些结果表明过表达植株通过降低电导率,丙二醛和H2O2的积累以及提升脯氨酸的含量应对低温胁迫。7、对转基因植株35S::HHbSnRK2.6A和35S::HHbSnRK2.6B进行低温胁迫处理,qRT-PCR结果显示,在低温胁迫下,转基因植株中冷相关基因CBF1,CBF2,CBF3,COR47和RD29A等基因表达量明显高于野生型,且与野生型存在显著性差异。这说明HbSnRK2.6通过增强下游冷胁迫相关基因的表达量来应对外界的低温胁迫,提高对低温环境的耐受性。8、将HbnRK2.6A-E的CDS以及HbICEs-N的CDS分别构建到酵母捕获载体pGADT7和诱饵载体pGBKT7上,共转化酵母AH109菌株,检测HbSnRK2.6s与橡胶树HbICEs的相互作用,结果显示HbSnRK2.6A-E与HbICEI,HblCE2均存在相互作用,暗示HbSnRK2.6s可能通过与低温信号关键因子HbICEs相互作用,调控橡胶树低温性能。9、通过对HbSnRK2.6A和HbSnRK2.6B进行原核表达和纯化,结果显示:HbS nRK2.6A 和 HbSnRK2.6B 在 16℃,0.6 mmol/L IPTG 浓度下,将蛋白诱导 16 h,其表达量最高。在50 mM咪唑和100 mM咪唑洗脱下来,得到纯化的蛋白,为HbSnRK2.6蛋白是否磷酸化HbICEs进而调控HbICEs的蛋白活性提供实验基础。以上研究结果表明:在低温胁迫下,巴西橡胶树HbSnRK2.6能够与橡胶树低温信号关键因子HbICEs相互作用,通过调控下游冷胁迫相关基因的表达改变植株细胞的相关指标来提高植物抵御低温胁迫的能力。