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1研究背景心在五脏的相对位置居于上,五行属火,心气通于夏,为阳中之阳。尽管心病的病变机理与临床表现各有不同,但是心病的主要病理基础为心阳虚弱,抓住这一主要病理基础就能从整体上把握住心病的主要矛盾。李东垣创的当归补血汤以黄芪、当归两味药物以5：1比例配伍而成,用于治疗劳倦内伤、气血虚、阳浮于外之虚热证。黄芪补气,气为阳,对于心气的温通作用较强,大剂量为君；心依赖血的濡养,血是气的载体,气必须依附于血才能运行到全身,且阴阳互根,阳无阴则阳无以化,需要补血的当归,辅以小剂量为臣,两者共同作用,对于心血管疾病的治疗有一定的疗效。2研究目的通过对当归补血汤及其有效成分(黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷、当归挥发油)抗AS及抑制心肌细胞凋亡的药效研究,探讨当归补血汤及其有效成分(黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷、当归挥发油)对OX-LDL作用下小鼠源性RAW264.7细胞吞噬作用的影响,TNF-a、IL-1β炎性因子的分泌,TNF-a、ICAM-1、P38-MAPK、NF-kBP65蛋白表达的影响；对氧化应激损伤状态下心肌细胞存活率的影响,对线粒体凋亡途径相关调控蛋白Hsp-70、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。研究当归补血汤抗AS及其抑制心肌细胞凋亡的作用机制及主要作用成分,为当归补血汤及提取有效成分治疗心血管疾病提供实验依据。3研究方法3.1当归补血汤及有效成分对OX-LDL作用于RAW264.7细胞的影响按1：1、2：1、3：1、5：1质量比取黄芪、当归道地药材,文火水煎并浓缩成含生药1.04g/mL的煎液,空白血清组灌胃等量生理盐水,各组以20mL/kg剂量灌胃,每日早晚各一次,持续3天,于第4天上午以30mL/kg剂量一次性灌胃,1h后采取眼眶静脉丛血,静置2-4h后以10,000rpm离心10min,取上清。黄芪甲苷、阿魏酸标准品购于广州市药品食品检验所,黄芪总皂苷购于上海阿拉丁试剂公司。当归挥发油采用水提法提取,以当归500g,加蒸馏水4000mL煮沸6-8h进行提取,以10,000rpm、l0min离心3次提纯得到挥发油360mg,分装,密封纸密封置于4V保存。RAW264.7细胞以DMEM高糖培养基加10%胎牛血清(FBS)培养,隔天换液,每2天传代1次。细胞以8000个/mL密度种于96孔板,过夜培养后换无血清培养基同步24h,MTT法检测当归补血汤含药血清及有效成分对RAW264.7细胞存活率的影响。RAW264.7细胞与50mg/LOX-LDL作用48h制备泡沫细胞模型,油红0染色法鉴定当归补血汤含药血清及有效成分对RAW264.7细胞吞噬OX-LDL的影响。当归补血汤有效成分与OX-LDL作用24h, ELISA法检测其对TNF-a、IL-1β分泌的影响。Western-blotting法检测OX-LDL与RAW264.7细胞作用24h,当归补血汤及有效成分对P38-MAPK、NF-kBP65、TNF-a、ICAM-1蛋白表达的影响。3.2当归补血汤及有效成分对H202诱导心肌细胞凋亡的影响取出生后1-3d的SD大鼠,用75%乙醇溶液浸泡消毒皮肤后,开胸取出心脏,移入超净工作台,用无菌锋利眼科剪剪成1mm3组织碎块,加入复合酶消化液(0.125mg/L胰蛋白酶+0.1mg/LI型胶原酶),含血清培养基终止消化,1000rprm、10min离心,弃上清,完全培养基悬浮细胞沉淀。运用酶消化法反复多次消化,收集细胞悬液,以90min差速贴壁法分离纯化心肌细胞,在37℃、5%C02条件下用完全培养基培养48h后换液,于培养72h后进行实验。以150μmol/L H2O2作用20h诱导心肌细胞凋亡。MTT法检测当归补血汤含药血清及有效成分对H202诱导心肌细胞凋亡细胞存活率的影响。细胞免疫化学法及蛋白印迹(Western-blotting)法检测当归补血汤含药血清及有效成分对H202诱导心肌细胞凋亡相关蛋白Hsp-70、Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响。4研究结果4.1当归补血汤及有效成分对OX-LDL作用于RAW264.7细胞的影响4.1.1与正常对照组相比,空白血清组对细胞增殖无影响(P<0.05),当归补血汤不同比例含药血清组均对RAW264.7细胞有促凋亡作用(P<0.05或P<0.01),以5：1组促凋亡作用最为显著；黄芪甲苷100、200mg/L浓度对RAW264.7细胞增殖无影响(P>0.05),300mg/L及以上浓度有明显的促凋亡作用(P<O.05或P<0.01)；阿魏酸、黄芪总皂苷100、200mg/L浓度对RAW264.7细胞有促增殖作用(P<0.01),300mg/L对RAW264.7细胞增殖无影响(P>0.05),400、500mg/L浓度有明显的促凋亡作用(P<0.01)；当归挥发油40、50mg/L浓度对RAW264.7细胞增殖无影响(P>0.05),60mg/L及以上浓度对RAW264.7细胞有促凋亡作用(P<0.05或P<0.01)。4.1.2细胞与OX-LDL培养48h后观察到50mg/L浓度即可诱导出泡沫细胞,后续实验中以50mg/L浓度进行实验研究；油红0染色结果发现,当归补血汤不同比例含药血清组均促进了RAW264.7细胞吞噬OX-LDL的作用,且5：1组可观察到含药血清对泡沫细胞有明显的降解作用；黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷、当归挥发油均促进细胞吞噬OX-LDL的作用。4.1.3ELISA检测结果发现,模型组IL-1β的表达与正常对照组、阿魏酸组、黄芪甲苷组、阿魏酸合黄芪甲苷组、黄芪总皂苷及当归挥发油组无差别(P>0.05),表达低于黄芪总皂苷合当归挥发油组。模型组TNF-a表达与正常对照组、阿魏酸组、黄芪甲苷组、阿魏酸合黄芪甲苷组没有差别(P>0.05),表达低于黄芪总皂苷、当归挥发油组、黄芪总皂苷合当归挥发油组。4.1.4Western-blotting结果显示,正常对照组、各含药血清组P38-MAPK、NF-kBP65、TNF-a、ICAM-1蛋白表达均比模型组高。与模型组相比较,阿魏酸、黄芪总皂苷药物组TNF-a、ICAM-1、NF-kBP65、P38-MAPK表达均比模型组低,黄芪甲苷、阿魏酸合黄芪甲苷、当归挥发油组ICAM-1表达比模型组低,但各组表达均比正常对照组低。4.2当归补血汤及有效成分对H202诱导心肌细胞凋亡的影响4.2.1倒置相差显微镜下观察,刚接种的心肌细胞呈球形,悬浮于培养液中,细胞折光性好。24h后观察到有部分细胞呈杆状贴壁,并出现白发性抽搐样搏动。48h后可见大部分细胞伸出伪足相互连系在一起,呈现有规律的搏动。72h后可见细胞出现同步有规律的搏动,且形成细胞簇,用于实验研究。4.2.2不同浓度H202溶液与心肌细胞作用20h,研究发现100、200μmol/L浓度即可明显造成细胞凋亡(P<0.01),300μmol/L及以上浓度细胞凋亡显著下降(P<0.01),结合细胞形态学观察,考虑到H202见光见热易分解的特性,选择150μmol/L浓度进行实验。4.2.3实验结果发现芪归不同比例的含药血清均能明显提高心肌细胞的存活率(P<0.01),且以5：1组效果最好,各组与空白血清组相比差异有统计学意义(P<0.01)。不同浓度黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷对心肌细胞有明显的保护作用(P<0.05或P<0.01),且随着药物浓度的升高,心肌细胞的存活率也随着升高；不同浓度当归挥发油对心肌细胞均没有保护作用,且促进心肌细胞的凋亡,各浓度组之间没有区别(P>0.05)。4.2.4细胞免疫化学法检测结果：与正常对照组比较,150μmol/LH2O2处理心肌细胞20h后,模型组心肌细胞中Hsp-70、Bcl-2表达略增多,Bax、Caspase-3蛋白表达明显增加。与模型组相比,当归补血汤含药血清(5：1)组能明显促进Hsp-70、Bcl-2蛋白的表达,降低Caspase-3、Bax蛋白的表达；黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷预处理后,心肌细胞中Hsp-70、Bcl-2蛋白表达量均较模型组显著增加,Bax、Caspase-3蛋白表达显著降低。4.2.5Western-blotting检测结果：150μmol/LH2O2处理心肌细胞20h后,与正常对照组比较,模型组心肌细胞中Bax、Caspase-3蛋白的表达明显增加,Hsp-70表达略增多,Bcl-2蛋白表达明显下降；当归补血汤不同比例含药血清组与模型组相较,Hsp-70、Bcl-2蛋白表达明显上升,Caspase-3、Bax蛋白表达明显下降；黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪甲苷合阿魏酸、黄芪总皂苷、当归挥发油(小剂量)、黄芪总皂苷合当归挥发油预处理后,心肌细胞中Hsp-70、Bcl-2蛋白表达量均较模型组显著增加,Bax、Caspase-3蛋白表达显著降低。5结论5.1当归补血汤通过促进巨噬细胞凋亡和降解泡沫细胞治疗动脉粥样硬化。5.2大剂量的黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷、当归挥发油通过促进巨噬细胞的凋亡发挥抗AS作用。5.3当归补血汤、黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷、当归挥发油不是通过巨噬细胞吞噬OX-LDL发挥抗AS作用的。5.4不能认为黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷、当归挥发油通过抑制TNF-a、IL-β炎性因子的表达起到抗AS的作用。5.5不能认为当归补血汤及有效成分通过抑制TNF-a、ICAM-1、NF-Kbp65、P38-MAPK蛋白表达达到抗AS作用。5.6当归补血汤及黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷可以抑制H202诱导的心肌细胞凋亡,保护心肌细胞。5.7当归补血汤、黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪总皂苷可能通过上调Hsp-70、Bcl-2,下调Caspase-3、Bax蛋白的表达抑制心肌细胞的凋亡,防止心肌细胞氧化损伤,从而在治疗心血管疾病方面发挥作用。6创新点6.1通过心病的主要病因病机“心阳虚”探讨当归补血汤配伍及用药的合理性。6.2在动脉粥样硬化斑块形成的源头——巨噬细胞吞噬OX-LDL方面研究当归补血汤及有效成分抗动脉粥样硬化的作用机理。6.3研究当归补血汤抗动脉粥样硬化的同时有效保护心肌细胞的作用,多靶点防冶心血管疾病。7展望与不足随着现代生物医学技术的发展及对心血管疾病研究的深入,将有望攻破心血管疾病这一难关,有效改善人们的生活质量,减轻人们的经济负担。在本实验中选择的实验指标有限,中药具有多靶点、多途径的作用特点,可能通过其他途径发挥治疗作用,有待于进一步深入研究。