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红曲霉（Monascus）作为我国重要的微生物资源，已经有着上千年的应用历史。其在生长过程中能产生红曲色素、γ-氨基丁酸（丫-Aminobutyric Acid，GABA）、MonacolinK、固醇、异黄酮、不饱和脂肪酸、蛋白酶等多种生理活性物质。GABA作为红曲霉多种代谢产物之一，具有抵抗焦虑、降低血压、改善脑部机能、促进生长激素分泌、活化肝功能、肾功能等作用，已经发展成为一种新型的功能性因子。几年前，红曲霉的研究主要集中在菌种分类选育、活性成分分离纯化及发酵工艺条件优化等方面，近年来，分子生物学的研究也逐渐起步，但很多尚处于探索和建立方法的阶段，对红曲霉的遗传背景知识了解很少，对GABA代谢相关基因的研究工作更是鲜见报道。
本研究以实验室保存的红色红曲霉（Monascus ruber）菌种Mr-5为实验材料，建立了根癌农杆菌介导红色红曲霉的高效转化体系，通过形态观察及显微特征分析，筛选获得了一批形态特征变化明显的转化子，并初步研究了其主要代谢产物。在此基础上，采用TAIL-PCR技术扩增了部分转化子T-DNA插入位点的侧翼序列。主要研究结果如下:
1、根癌农杆菌介导的红色红曲霉T-DNA插入突变体库的构建
利用根癌农杆菌介导的转化技术，通过对根癌农杆菌浓度、红色红曲霉培养时间、红色红曲霉分生孢子液浓度、诱导剂乙酰丁香酮(AS)浓度、根癌农杆菌与红色红曲霉的共培养温度、共培养时间、共培养膜类型等转化因素的优化，建立了根癌农杆菌介导红色红曲霉的高效转化体系:红色红曲霉在PDA培养基上培养21 d后收集孢子，制备红色红曲霉孢子悬浮液，浓度为106孢子/mL，根癌农杆菌浓度OD600为0.5，诱导剂AS浓度为100μmol/L，根癌农杆菌与红色红曲霉在硝酸纤维素膜(NC膜)上25℃共培养3d。采用此体系成功构建了含有1300多个红色红曲霉转化子的T-DNA插入突变体库。
2、转化子的遗传稳定性分析、PCR鉴定及形态观察
将1300多株红色红曲霉转化子接种于PDA培养基，随机挑选50株转化子接种到不含潮霉素B的PDA培养基上，30℃培养7d。连续转接6次后，再转接到含200μg/mL潮霉素B的PDA培养基上，同时接种出发菌株Mr-5作为对照，30℃培养，观察菌落生长情况，计算其稳定性。同时提取基因组DNA进行潮霉素抗性基因PCR鉴定。结果显示，上述转化子的遗传稳定性高达98％，并且转化子菌株的基因组中均有T-DNA插入。
将1300多株红色红曲霉转化子菌株接种到PDA培养基上，30℃培养7d，进行菌落形态及显微形态观察。结果表明，大部分转化子与原始菌株差别不大，只有少数转化子在菌落颜色、菌落隆起、生长速度、气生菌丝、菌丝表面附着物、分生孢子形状、闭囊壳数量及形态等方面发生了较大变化。
3、转化子的主要代谢产物分析
采用纸层析、UV-VIS、TLC等方法测定了突变体库中红色红曲霉转化子的GABA、色价和桔霉素含量，结果显示，与原始菌株相比，转化子菌株产代谢产物的能力发生了不同程度的变化。GABA方面，14株代表性转化子菌株中有13株的GABA产量有明显高于原始菌株Mr-5，其中Mr-5-50的产量达到3.161g/L，约为Mr-5的4.37倍;色价方面，4株转化子菌株在505nm处的色价明显升高，其中Mr-5-155高达106.5 U/mL，是Mr-5色价33.27 U/mL的3.2倍;2株转化子菌株的色价明显降低，其中Mr-5-33菌株的色价仅为7.48 U/mL，只有Mr-5的0.22倍。同时，部分转化子菌株在300-600 nm的吸收波长也发生了不同程度的变化，如Mr-5-7、Mr-5-35、Mr-5-38、Mr-5-54、Mr-5-59、Mr-5-97、Mr-5-155均有三个吸收峰，Mr-5-46和Mr-5-50均只有390-400 nm左右的一个吸收峰，Mr-5-158吸收峰不明显，而原始菌株Mr-5有两个吸收峰。桔霉素方面，5株转化子菌株发酵液中的桔霉素含量有所降低，其中Mr-5-50的桔霉素含量未检测出，可能低于TLC方法能够检测的最低值0.2μg/g。
4、转化子侧翼序列扩增及生物信息学分析
采用TAIL-PCR技术对14株红色红曲霉GABA转化子菌株T-DNA插入位点的右臂侧翼序列进行了扩增，成功获得了转化子Mr-5-72的T-DNA右侧序列，命名为gabaX-72，大小为405 bp，对其氨基酸序列进行了同源性搜索，发现其与构巢曲霉（Aspergillusnidulans）FGSC A4的假定蛋白AN7090.2有98％相似性。综合研究发现，Mr-5-72在气生菌丝形态、分生孢子产生能力、菌落生长速度、红曲色素和桔霉素产量等方面都与原始菌株Mr-5差别不大，但液体发酵产生的GABA量达到了Mr-5的4倍以上，推测T-DNA插入最有可能是影响了GABA合成途径中所需基因的序列，导致GABA产量发生了较大变化，有进一步研究的价值。