类鼻疽(Melioidosis)疾病是由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）引起的一种热带亚热带地区人畜共患传染病。由于类鼻疽病易感动物的广谱性、疾病的高致死性以及流行范围不断扩大的趋势，该病已经成为全球的公共卫生问题。类鼻疽伯克霍尔德菌是一种革兰氏阴性杆菌，有极高的感染性和对环境的极强的抵抗能力，已被美国疾病控制和预防中心列为B类生物战剂。此外临床上类鼻疽杆菌感染的多重耐药菌性，使得其感染的治疗是异常困难。因此发展新的预防和治疗策略非常重要。疫苗是预防和控制感染性疾病有效、经济的手段。就类鼻疽杆菌疫苗研究而言，已经有很多研究就全菌灭活疫苗、成份疫苗、结合疫苗等方面进行了尝试，但目前还没有一种应用于临床。重组亚单位疫苗是通过重组表达能够有效刺激机体产生具有保护性免疫反应的抗原分子(主要是蛋白抗原)，从而达到预防和控制疾病的目的。亚单位疫苗因为其成份清楚、质量可控、成本较低，已经成为新型疫苗发展的重要方向。鞭毛蛋白(flagellin, FliC)作为细菌表面主要抗原，其氨基酸序列高度保守，是引起免疫反应的重要抗原成份之一，已广泛用于该细菌感染的诊断，并可作为亚单位疫苗的候选抗原成份。本文分别采用pET22b、pET28a以及pGEX载体进行FliC的表达，结果均不理想。课题组前期在研究肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7的Ⅲ型分泌系统重要元件(Escheriochia coli secret protein A，EspA)的功能时发现其具有促进外源蛋白表达的作用，并构建了基于EspA的表达载体pEspA。本研究拟采用该表达系统重组表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157:H7EspA融合蛋白，并评价其免疫学性质，为发展针对类鼻疽杆菌和EHEC O157:H7的二联疫苗奠定基础。方法1bpsl3319基因的克隆和重组表达质粒的构建以类鼻疽杆菌BPC006基因组DNA为模板，PCR扩增FliC编码基因bpsl3319，通过DNA重组技术连接到不同表达质粒pET22b(+)、pET28a (+)、pGEX和pEspA，酶切后测序鉴定阳性重组子，转入大肠杆菌BL21，获得重组表达工程菌。2重组蛋白EspA-FliC的表达和纯化重组工程菌pEspA-FliC经IPTG诱导剂诱导后，超声破菌，SDS-PAGE电泳分析重组蛋白EspA-FliC表达形式。EspA-FliC融合蛋白经过包涵体洗涤、使用阴离子交换层析和凝胶过滤层析，纯化后产物超滤离心浓缩，采用BCA法测定蛋白浓度。3融合蛋白EspA-FliC免疫学性质研究3.1融合蛋白的反应性检测Western blot检测融合蛋白与类鼻疽杆菌多抗和EspA单克隆抗体、EspA多抗免疫反应性。3.2融合蛋白的免疫原性检测纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，ELISA方法检测血清特异性抗体的滴度；并通过Western blot检测免疫血清与类鼻疽杆菌全菌、融合蛋白及EspA的反应性。结果1成功克隆了类鼻疽杆菌FliC编码基因bpsl3319，并构建了重组表达质粒pET22b-bpsl3319、pET28a-bpsl3319、pGEX-bpsl3319和pEspA-bpsl3319，FliC在前三种表达系统中未见明显表达，仅在pEspA系统获得高效表达。2重组工程菌pEspA-FliC/BL21经过IPTG诱导后，融合蛋白EspA-FliC表达量约占菌体总蛋白的35％，纯化后蛋白纯度大于85％。3EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EspA的单抗或多抗血清发生特异性抗原抗体反应，表现出良好的免疫反应性。4EspA-FliC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG，而且此抗体能识别EspA-FliC、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC，表现出良好的免疫原性。结论本研究采用DNA重组技术成功表达了具有良好免疫原性和免疫反应性的类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与肠出血性大肠杆菌EspA的融合蛋白，为研制类鼻疽杆菌和肠出血性大肠杆菌O157：H7的二联疫苗奠定了基础。